柑橘加工废渣糖蜜糖分的分离提取及含量测定

柑橘加工废渣糖蜜糖分的分离提取及含量测定彭雪娇;黄林华;王华;谈安群;郭莉【摘要】该研究采用脱脂和醇沉相结合的方法对长叶橙加工废渣中的柑橘糖蜜糖分进行分离提取,考察脱脂工艺参数(脱脂剂用量、脱脂剂中石油醚体积分数、回流时间)以及醇沉工艺参数(乙醇浓度、乙醇用量、醇沉时间)对粗多糖提取率的影响,在单因素实验的基础上分别进行Box-Behnken响应面优化,确定最佳工艺•在最佳工艺条件下,采用3,5-二硝基水杨酸法和蒽酮试剂法对澄清果肉渣糖蜜、未澄清果肉渣糖蜜、澄清果皮渣糖蜜、未澄清果皮渣糖蜜4个样品进行还原糖、蔗糖和多糖含量测定.Box-Behnken响应面优化结果表明，最佳脱脂工艺为脱脂剂用量20倍、脱脂剂中石油醚体积分数90%、回流时间3.5h,最佳醇沉工艺为乙醇体积分数99%、乙醇用量8倍、醇沉时间8h,在此条件下粗多糖提取率为5.47%;样品测定结果表明,果肉渣糖蜜的总糖分含量高于果皮渣糖蜜,澄清后糖蜜纯度增加,多糖含量降低.％Refluxdegreasingandethanolprecipitationwerecombinedtoseparateandextractsugarsofmolassesfromcitrusprocessingwasteoflongleaforange.Crudepolysaccharideextractionwasstudiedwithrefluxdegreasing(includingdegreaserdosage,petroleumethercontent,andrefluxtime)andethanolprecipitation(includingethanolcontent,ethanoldosage,andprecipitatingtime)byresponsesurfaceoptimization.Sugarsinfoursamples,includingclarified-pulpmolasses,non-clarified-pulpmolasses,clarified-peelmolasses,andnon-clarified-peelmolassesweredeterminedby3,5-dinitrosalicylicacidmethodandanthronereagentmethod.Undertheoptimumrefluxdegreasingconditions(degreaserdosage20times(v/v),petroleumethercontent90%andrefluxtime3.5h)andethanolprecipitationconditions(ethanolcontent99％,ethanoldosage8times(v/v)andprecipitatingtime8h),theaveragevalueofpolysaccharideextractionwas5.47％.Theresultsshowedthattotalsugarcontentinpulpmolasseswashigherthaninpeelmolasses;puritywasincreasedafterclarifying.However,polysaccharidecontentwasdecreased.【期刊名称】《食品与发酵工业》年(卷),期】2017(043)005【总页数】8页(P247-254)【关键词】柑橘糖蜜;糖分;分离提取;含量测定【作者】彭雪娇;黄林华;王华;谈安群;郭莉【作者单位】西南大学柑桔研究所,中国农业科学院柑桔研究所,重庆,400712;西南大学柑桔研究所,中国农业科学院柑桔研究所,重庆,400712;西南大学柑桔研究所,中国农业科学院柑桔研究所,重庆,400712;西南大学柑桔研究所,中国农业科学院柑桔研究所,重庆,400712;西南大学柑桔研究所,中国农业科学院柑桔研究所,重庆,400712【正文语种】中文近年来，我国柑橘种植面积和产量居世界首位，每年大量的柑橘用于加工，榨汁后产生40%~50%的皮渣［1］，具有极高的生物需氧量，若不经处理直接排放，则易造成环境污染。鲜柑橘果皮渣约含5%~8%的糖分，果肉渣约含8%~11%的糖分，为保护环境、充分资源化利用，经压榨、蒸发浓缩后可制得柑橘糖蜜［2］。柑橘糖蜜是一种高糖度的深褐色黏稠液体，主要成分为单糖(葡萄糖、果糖为主)、双糖（蔗糖为主）及少量多糖。葡萄糖、果糖和蔗糖是很好的发酵碳源，能被绝大多数微生物利用，如酵母发酵葡萄糖和蔗糖产生酒精［3-4］，黑曲霉发酵蔗糖产生柠檬酸［5-7］，乳酸菌发酵葡萄糖和果糖产生乳酸等［8-9］。柑橘多糖以果胶多糖为主，是一种酸性杂多糖，结构复杂，具有抗氧化、抗肿瘤、调血脂、刺激免疫活性等多种生物活性［10-11］。与玉米、甜菜、甜高粱等一般发酵原料相比，柑橘糖蜜的原料是柑橘加工废渣，成本几乎为零，更具市场竞争力。目前，糖蜜市场以甘蔗糖蜜为主，交收检验以提交总糖分和锥度检验报告为主，再根据检验报告以总糖分定价［12］。柑橘糖蜜作为糖蜜的一个类别，准确测定其糖分组成及含量，既便于柑橘糖蜜定价，又能为柑橘糖蜜品质综合评价提供可靠的数据支撑。糖分组成及含量测定之前，需对柑橘糖蜜进行脱脂和醇沉，以便有效分离多糖，减少脂质对多糖提取和含量测定的干扰［13-15］。近年来，植物多糖的提取工艺优化主要集中于脱脂工艺或者醇沉工艺，未见在同一提取过程同时优化两者的研究。本研究对脱脂工艺和醇沉工艺分别进行单因素实验和响应面优化，确定粗多糖最佳提取工艺。利用优化后的工艺，对澄清果肉渣糖蜜、未澄清果肉渣糖蜜、澄清果皮渣糖蜜、未澄清果皮渣糖蜜4个实际样品的糖分进行分离提取及含量测定，旨在为其进一步开发利用提供可靠依据。材料与试剂长叶橙果肉渣、长叶橙果皮渣，均取自中国农业科学院柑桔研究所中试车间。石油醚（沸程60-90°C）、乙酸乙酯、无水乙醇、Na2SO3、浓HCI、浓H2SO4,重庆川东化工（集团）有限公司；葡萄糖（纯度＞99.8%）.蔗糖（纯度＞99.9%）,北京索莱宝科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸、NaOH，成都市科龙化工试剂厂；蔥酮，国药集团化学试剂有限公司，上述试剂除特殊说明外均为分析纯。仪器与设备TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；HH系列恒温水浴锅，江苏金坛中大仪器厂；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；L-550台式低速大容量离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；FMC榨汁机，美国FMC公司；电子天平,赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；阿贝折光仪,上海精密科学仪器有限公司。柑橘糖蜜的制备取经FMC榨汁机榨汁后的长叶橙果肉渣，多次重复水洗，使糖分全部浸出，收集水洗液（2.8~6.0°Brix）,将其等分，取其中1份经果胶酶澄清处理，1份做离心处理；取经FMC榨汁机榨汁后的长叶橙皮渣，用切粒机将其切粒，加入3%生石灰，静置硬化后压榨，收集压榨液（3.5~5.6°Brix）,将其等分，取其中1份经离心过滤，1份不做任何处理；分别浓缩制得澄清果肉渣糖蜜、未澄清果肉渣糖蜜、澄清果皮渣糖蜜、未澄清果皮渣糖蜜。柑橘糖蜜糖分提取工艺流程脱脂工艺优化单因素实验以石油醚和乙醇作为脱脂剂，所用石油醚沸程在60~90°C,温度设定为（70±2）°C。固定条件为脱脂剂中石油醚体积分数100%、回流时间3h，考察脱脂剂用量（V脱脂剂/V样品=10、15、20、25、30）对粗多糖提取率的影响；固定条件为脱脂剂用量20倍、回流时间3h，考察脱脂剂中石油醚体积分数（60%、70%、80%、90%、100%）对粗多糖提取率的影响；固定条件为脱脂剂中石油醚体积分数100%、脱脂剂用量20倍，考察回流时间（1、2、3、4、5h）对粗多糖提取率的影响。以上实验，固定醇沉条件均为乙醇浓度100%、乙醇用量6倍体积比、醇沉时间10h，醇沉温度4C。响应面优化在单因素实验的基础上，选取脱脂剂用量(A)、脱脂剂中石油醚体积分数(B)、回流时间(C)3个因素，以粗多糖提取率(Y)为响应值，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理进行3因素3水平的实验设计，研究响应值和最佳变量组合优化。醇沉工艺优化单因素实验按照最佳脱脂工艺对柑橘糖蜜进行脱脂，醇沉温度设定为4°C。固定条件为乙醇用量为6倍、醇沉时间8h，考察乙醇浓度(70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%)对粗多糖提取率的影响；固定条件为乙醇浓度100%、醇沉时间8h，考察乙醇用量(V乙醇/V样品=2、4、6、&10、12)对粗多糖提取率的影响；固定条件为乙醇浓度100%、乙醇用量为6倍，考察醇沉时间(2、4、6、8、10、12h)对粗多糖提取率的影响。响应面优化在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度(XI)、乙醇用量(X2)、醇沉时间(X3)三个因素，以粗多糖提取率(Y)为响应值，根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，进行3因素3水平的实验设计，研究响应值和最佳变量组合优化。糖分含量测定多糖含量测定多糖含量式中：X多糖，对应标准曲线中的蔗糖质量，pg;V1,稀释糖液的定容体积,mL;V2，醇沉时吸取稀释糖液的体积，mL；V3，粗多糖提取物的定容体积，mL；V4，多糖待测液的取样体积，mL;106，单位换算，g-pg;m粗多糖，粗多糖提取物的质量,g；m样，样品的质量，g。还原糖和转化糖含量测定还原糖和转化糖的测定参考文献［16］中的DNS法，蔗糖的转化参考文献［17］并加以改进。取50mL待测溶液于100mL容量瓶中，加入3mL浓盐酸（80±2）°C水浴30min,取出冷却，加入2滴甲基红指示剂，再用40%、10%NaOH溶液和1:3HCI溶液中和，定容至刻度线，即为转化糖待测液。分别精确吸取2.0mL还原糖待测液和转化糖待测液于25mL刻度试管中，加入mLDNS试剂，按照葡萄糖标准曲线测定方法操作，测定还原糖和转化糖待测液吸光度。还原糖含量转化糖含量蔗糖含量/%=（转化糖含量-还原糖含量）x0.95式中：X还原糖、X转化糖，对应标准曲线中的葡萄糖质量,mg;V1,稀释糖液的定容体积,mL;V2:醇沉时吸取稀释糖液的体积,mL;V5,离心后上清液的定容体积,mL;V6,还原糖待测液的取样体积,mL;V7,转化糖待测液的定容体积,mL;50,溶液转化时的取样体积，mL;V9,转化糖待测液的取样体积，mL;103，单位换算，g-mg;0.95，转化糖换算成蔗糖的系数。样品糖锥度测定按照《QB/T2684—2005甘蔗糖蜜》中折射法测定柑橘糖蜜锥度。纯度数据分析采用MicrosoftOfficeExcel2007进行数据统计，将平行3次的实验结果以（平均值±标准差）的形式表示，以Origin8.6专业函数绘图软件绘制单因素实验结果图，DesignExpert8.0.6进行响应面试验设计和结果分析。脱脂工艺优化结果分析单因素实验由图1(A)可知，粗多糖提取率随脱脂剂用量的增大而增加，在20倍时，粗多糖提取率最大，继续增大脱脂剂用量，粗多糖提取率降低。与本研究结果相似，韦媛媛［15］等研究积雪草脱脂工艺，发现脱脂剂用量大于10倍后，多糖提取率逐渐降低脱脂剂用量增大，脂溶性成分与脱脂剂的结合增加，脱脂效率增加，但脱脂剂过量将溶解样品中部分多糖，使部分多糖被除去，造成粗多糖提取率降低。此外，在相同温度条件下，脱脂剂用量过大，溶液不易达到有效回流温度，不利于多糖的提取故在本研究中选取20倍作为最佳脱脂剂用量。由图1(B)可知，粗多糖提取率随脱脂剂中石油醚体积分数的增大而增加，在80%时，提取率最大，继续增加脱脂剂中石油醚体积分数，粗多糖提取率降低。张斌［14］等利用甘蔗渣提取多糖，结果表明脱脂剂中石油醚体积分数为90%时，多糖提取率最高，增加或减少石油醚体积分数，多糖提取率均降低。故在本研究中选取80%作为最佳脱脂剂中石油醚体积分数。由图1(C)可知，粗多糖提取率随回流时间的延长而增加，在3h时，粗多糖提取率最大，继续增加回流时间，粗多糖提取率降低。韦媛媛［15］等在积雪草多糖脱脂工艺的研究中，回流时间对多糖提取率的影响与本研究结果相似，在6h时多糖提取率最大，增加或减少回流时间，多糖提取率均降低。回流时间对多糖提取率的影响，主要表现为随着回流时间的增加，脱脂剂在溶解脂质后会进一步溶解样品中的多糖，造成多糖的部分损失；同时，长时间的高温处理使多糖发生部分将解，导致粗多糖提取率下降。故本研究选取3h作为最佳回流时间。响应面优化根据单因素实验结果，各因素水平及编码见表1。实验过程中发现，脱脂剂中石油醚体积分数为70%时，石油醚用量较少，随着回流时间的增加，石油醚损失增加，粗多糖提取率较低，故将脱脂剂中石油醚体积分数选在80%以上。对表2所得的实验数据进行回归拟合，得到以粗多糖提取率为目标函数的二次回归方程：Y=5.55-0.29A-0.33B+0.15C+0.23AB-0.17AC-0.090BC-0.59A2-1.01B2-0.46C2。采用Design-Expert8.0.6软件处理数据，对该模型进行回归方差分析，结果见表3。由表3可知，该模型中3个因素对柑橘糖蜜粗多糖提取率的影响顺序为脱脂剂中石油醚体积分数(B)>脱脂剂用量(A)>回流时间(C)，其中A、B均表现为极显著，C表现为显著，交互项AB显著，AC、BC不显著，二次项A2、B2、C2均达到极显著水平。进一步分析表3可知，总模型PV0.0001,表明该试验模型极显著；失拟项为0.5432>0.05，不显著，表明该回归模型与实测值拟合度高。R2=0.9778>0.9，该模型相关度高，模型可靠；=0.9493，该模型可解释94.93%的响应值变化。由图2(A)可知，脱脂剂用量与脱脂剂中石油醚体积分数对粗多糖提取均有显著影响，随着脱脂剂用量和脱脂剂中石油醚体积分数增大，粗多糖提取率均表现为先增加后降低，两者的的交互作用显著，相互作用相当。由图2(B)可知，随着回流时间的增加，响应面曲线在3h之前坡度较大，3h之后趋于平缓；随着脱脂剂用量的增大，响应面曲线呈弧形，多糖提取率表现为先增加后降低；从响应面曲线图来看，脱脂剂用量对粗多糖提取率的影响较回流时间的影响显著。由图2(C)可知，随着脱脂剂中石油醚体积分数的变化，响应面曲线呈弧形，曲面弯曲；随着回流时间的增大，响应面曲线增长较慢，且在3h后曲面较为平滑；说明，与回流时间相比，脱脂剂中石油醚体积分数对粗多糖提取率的影响更为显著。通过Design-Expert8.0.6软件进行数据分析，得到粗多糖最佳脱脂工艺条件为脱脂剂用量18.39倍、脱脂剂中石油醚体积分数87.88%、回流时间3.24h，模型预测柑橘糖蜜粗多糖提取率为5.65%。考虑实际情况，确定最佳脱脂工艺条件为脱脂剂用量20倍、脱脂剂石油醚体积分数90%、回流时间3.5h，在此条件下，平行试验3次，粗多糖提取率分别为5.49%、5.44%、5.39%，平均值为5.44%，与预测值相差不大。醇沉工艺优化结果分析单因素实验由图3(A)可知，乙醇浓度为70%-90%时粗多糖提取率增加较快，90%~95%时粗多糖提取率增加较缓，大于95%时几乎无明显增加。董洪新［18］等研究发现，醇沉白灵菇子实体多糖时乙醇最适浓度为80%，达到80%以上，多糖提取率增加缓慢。李义［19］等利用醇沉法提取马兰多糖的研究结果与本结果相似，一次性沉淀法中，乙醇浓度为95%时，多糖提取率最大。故在本研究中选取最佳乙醇浓度为95%。由图3(B)可知，粗多糖提取率随乙醇用量的增大而增加，当乙醇用量为8倍时达到最值，继续增加乙醇用量，粗多糖提取率无明显增加。与本研究结果相似，李顺峰［20］等在醇沉提取真姬菇子实体多糖的研究中发现，乙醇用量为4倍体积时，提取率最高，继续增加乙醇用量，导致部分多糖复溶，提取率降低。考虑到节约成本，本研究中选取最佳乙醇用量为8倍体积。由图3(C)可知，粗多糖提取率随醇沉时间的延长而增加，但醇沉8h后，粗多糖提取率缓慢降低。分析其原因是醇沉较长时间，多糖易分解，从而粗多糖提取率降低［21-22］。故本研究中选取最佳醇沉时间为8h。响应面优化根据单因素实验结果，各因素水平及编码见表4。对表5所得的实验数据进行回归拟合，得到以粗多糖提取率为目标函数的二次回归方程：Y=4.84+1.45X1+0.26X2-0.22X3-0.066X1X2+0.075X1X3+0.15X2X3-0.81X12-1.19X22-0.46X32。采用Design-Expert8.0.6软件处理数据，对该模型进行回归方差分析，结果见表6。由表6可知，该模型中3个因素对柑橘糖蜜粗多糖提取率的影响顺序为乙醇浓度(X1)>乙醇用量(X2)>醇沉时间(X3)，其中X1、X22均达到极显著水平，X12为显著水平，X1、X2、X3两两之间的交互作用对粗多糖提取率的影响不显著。进一步分析方差表可知，总模型P=0.0084<0.01，表明该试验模型极显著，该试验方法可靠；失拟项为0.2491>0.05，不显著，表明该回归模型与实测值拟合性较好R2=0.9778高于0.9，表明该模型相关度较高，模型可靠。由图4(A)可知，随着乙醇浓度的变化，响应面曲面陡峭；随着乙醇用量的变化，响应面曲面变化呈弧形，弧度较大；两者相互作用中乙醇浓度占主导作用。由图4(B)可知，随着醇沉时间的变化，响应面曲面较为平滑；与图4(A)相似，乙醇浓度对粗多糖提取率的影响更为显著，在两者的相互作用中占主导作用。由图4(C)可知，响应面在试验范围内比较平滑，无显著变化，两者相互作用相当。通过Design-Expert8.0.6软件进行数据分析，得到粗多糖最佳醇沉工艺条件为乙醇浓度99.41%、乙醇用量8.15倍、醇沉时间7.69h，在此条件下模型预柑橘糖蜜粗多糖提取率为5.51%。考虑实际情况，确定最佳醇沉工艺条件为乙醇浓度99%、乙醇用量8倍、醇沉时间8h，在此条件下，平行试验3次，粗多糖提取率分别为5.51%、5.43%、5.46%，平均值为5.47%，与预测值接近。实际样品糖分含量测定分析表7可知，果肉渣糖蜜的总糖分和纯度均大于果皮渣糖蜜，原因是果肉渣水洗液中细胞壁、细胞碎片、色素、灰分等杂质的含量相对较少，糖含量相对较高。分别比较1#和2#、3#和4#可知，澄清后糖蜜纯度增加，多糖含量降低，其中果肉渣糖蜜澄清后多糖降低62.18%，果皮渣糖蜜澄清后多糖降低25.66%。主要原因是多糖存在于植物细胞壁中［11］，果皮渣糖蜜采用离心过滤能除去部分细胞壁、细胞碎片等不溶性杂质，降低部分多糖含量；果肉渣糖蜜采用果胶酶法澄清使水洗液中的细胞壁被破坏，果胶溶出后被果胶酶降解成低聚糖或者单糖，再经离心去除细胞壁和细胞膜碎片，从而多糖含量大大降低，还原糖和蔗糖含量稍有增加［23］。实验在单因素实验基础上，分别对柑橘糖蜜多糖的脱脂和醇沉工艺进行了响应面优化，确定最佳脱脂工艺为脱脂剂用量20倍、脱脂剂中石油醚体积分数90%、回流时间3.5h;最佳醇沉工艺为乙醇浓度99%、乙醇用量8倍、醇沉时间8h;在此条件下，粗多糖提取率为5.47%。脱脂工艺中选用石油醚代替乙醚做脱脂剂，具有毒性低、原料易得、操作简便、安全易行等优势。目前，制糖企业总糖分检测多采用《QB/T2684—2005甘蔗糖蜜》规定的二次旋光法，糖蜜酒精生产企业多采用总还原物法，但旋光仪投资成本大，测定工作耗时耗力，总还原物法易受非糖有机物的影响，测定结果偏高［12］，对企业而言，既不经济也不实用。本研究中，采用蔥酮试剂法测定多糖，DNS法测定还原糖和转化糖，实验仪器精密度高，实验方法重复性好、回收率高，显色稳定，测定结果准确可靠，方法简单实用，成本较低，企业适用。样品测定结果显示，长叶橙柑橘糖蜜中多糖含量极少，糖分以还原糖和蔗糖为主，尤其是由果皮渣压榨液经澄清后制得的柑橘糖蜜中还原糖含量在总糖分中占比高达80%以上，极其适合用于以还原糖为发酵碳源的微生物发酵，如乳酸菌发酵生产乳酸、丙酸杆菌发酵生产VB12等。［1］ 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