TCACM 1326.23-2019 牛耳枫种子超低温保存技术规程

ICS11.120.01C23团 体 标 准T/CACM1326.23—2019牛耳枫种子超低温保存技术规程TechnicalcodeofpracticeforcryopreservationofDaphniphyllumcalycinumBenth.seeds2019-10-17发布 2019-10-17实施中 华 中 医 药 学 会 发布T/CACM1326.23—2019T/CACM1326.23—2019II目 次前言 II112范引文件 13语定义 14子收选择 24.1种采收 24.2种选择 25子处理 25.1活力 25.2含量围 26子存量 37子冻式 38复养 3种解处理 3冻种活检测 38.3萌成苗 3附录规性录）试剂配和存法 4参考献 5T/CACM1326.23—2019T/CACM1326.23—2019鏈鏈鏈鏈前 言本标准是药用植物顽拗性种子超低温保存系列标准之一，该系列标准结构和名称如下：——T/CACM1326.1药用植物顽拗性种子超低温保存技术通则；——T/CACM1326.2白木香种子超低温保存技术规程；——T/CACM1326.3——T/CACM1326.4——T/CACM1326.5——T/CACM1326.6——T/CACM1326.7——T/CACM1326.8——T/CACM1326.9樟种子超低温保存技术规程；——T/CACM1326.10两面针种子超低温保存技术规程；………………。GB/T1.1－2009本标准由中华中医药学会归口。牛耳枫种子超低温保存技术规程（DaphniphyllumcalycinumBenth.）本标准适用于牛耳枫种子的超低温长期贮藏。GB/T3543.6GB/T3543.7下列术语和定义适用于本文件。3.1牛耳枫 DaphniphyllumcalycinumBenth.（Daphniphyllaceae）（DaphniphyllumBl.）材料，对急慢性肠胃炎有较好的疗效。收载于《广东省中药材标准（2011）（2008）》。3.2牛耳果实 DaphniphyllumcalycinumBenth.fruits果实卵圆形，较小，长约7mm，被白粉，具小疣状突起，先端具宿存柱头，基部具宿萼。种子1个。3.3牛耳种子 DaphniphyllumcalycinumBenth.seeds牛耳枫的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子淡黄色，椭圆形，种脐位于基端腹侧，圆形。内果皮骨质，表面有突起的大网格。3.4种子超低温保存seedofcryopreservation将经过前处理的牛耳枫种子置于液氮（-196℃）中保存。18月～11月，当果皮颜色由绿色转为紫黑色时，即可采收，去除果肉，取出种子。挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4℃冰箱中保存备用（存放时间不超过30d）。活力牛耳枫种子活力以种子生活力为判别标准。按照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法检测种子生活力。随机抽取30粒种子，剥去外层种皮，沿种脊小心将种子分成2爿后放培养皿内，内侧面向下，滴入TTC溶液浸没种子，室温(25℃)避光放置4h后观察染色结果。TTC溶液的配制和保存方法见附录A的A.1和A.2。待保存的牛耳枫种子生活力应≥90％。计算生活力按照公式（1）进行计算：式中：A——生活力；y——有活力的种子数；x——总的种子数。用尼龙网袋包裹牛耳枫种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为50：120h～26h45％～50％降至13％～17按照GB/T3543.6（130℃烘干1（2）2式中：W0M1（g）；M2（g）牛耳枫种子保存量不少于400粒，以便后期的活力检测使用。牛耳枫种子超低温保存的冷冻方式为玻璃化冷冻法，即将装有种子的5mL冻存管（每管50粒种子）置于装载液（LS）中并于25℃处理种子20min，再用玻璃化保护溶液（PVS2）冰浴处理种子30min，换上预冷新鲜的PVS2后迅速投入液氮中进行超低温保存。LS和PVS2的配制及保存方法见附录A的A.3和A.4。液氮中至少冻存24h后，取出1个冻存管，立即放入40℃水浴中快速解冻5min，而后用洗涤液（DS）浸泡15min，并用纯净水洗涤3次。DS的配制及保存方法见附录A的A.5。取出25粒解冻后的种子，按照5.1活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力≥75％时视为保存成功。将剩下25粒解冻后的牛耳枫种子，50℃温水浸种24h后，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度25℃～30℃，湿度70％～85％条件下培养。牛耳枫种子出芽周期大概35d。3附 录 A（）TTC1.00100mL1％的TTCpH6.5～7.54溶液I：9.08g磷酸二氢钾溶于1L无菌水中。溶液II：35.81g磷酸二氢钠溶于1L无菌水中。按I﹕II=2﹕3的比例混合制成磷酸盐缓冲溶液。（LS）13.711.9MSpH至100mL，4（PVS2）精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亚砜13.6mL，称取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，调pH至5.8后，定容至100mL，高温高压灭菌，4℃冷藏。注：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。（DS）41.1g溶于MSpH至5.8100℃4参考文献45(1)卷[M].1980：008MingTien-lu,KlausKubitzki.Daphniphyllaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.200