化学生物絮凝与化学混凝污水处理工艺的微生物种群结构比较

化学生物絮凝与化学混凝污水处理工艺的微生物种群结构比较分析摘要：从化学生生物絮凝、化化学混凝污水水工艺的污泥泥样品中提取取总DNA，进行PCR扩增，结合DGGE（变性浓度度梯度凝胶电电泳），分析析了样品中微微生物种群结结构，讨论并并比较了在两两种污水处理理工艺中微生生物种群结构构的不同。结结果证明，在在化学生物絮絮凝污水处理理工艺中，微微生物种群庞庞大且复杂，并并对污染物的的处理起到较较为重要的作作用。关键词：化学学生物絮凝；；化学混凝；；PCR；DGGE；微生物种种群结构；SShannoon多样性指数数CompariisionoofCommmunittystrructurreanaalysissincchemiccalanndbioologiccalflloccullationnwithhchemiicalccoagullationnproccessAbstracct:Innthisspapeer,thhediffferennceoffthecommuunitystruccturebetweeenthhecheemicall-bioologiccalflloccullationnandchemiccalcooagulaationwasteewaterrtreaatmenttproccesshhasbeeendiiscusssedanndcommparieedwitthmolleculaarbioologiccalmeethodss,succhasDNAeextracction,,polyymerassechaainreeactioon(PCCR)annddennaturttingggradieentgeeleleectropphoressis(DDGGE)..Theresullthassindiicateddthatthighhnumbberoffbactteriallspecciesppresenntediintheesluddgeoffthechemiical-bioloogicallfloccculattionpprocessswitthcommplexiity,wwhichplayeedanimporrtantroleinthheremmovalofthhepolllutannt.KeyWorrds:cchemiccalanndbioologiccalflloccullationn,chemmicalcoaguulatioon,PCCR,DGGGE,aactivaatedssludgee,miccrobiaalcommmunittystrructurre,ShhannonnDiveersityyIndeex城市污水化学－－生物絮凝强强化一级处理理是利用化学学混凝和生物物絮凝联合作作用强化沉淀淀的污水处理理工艺，一般般由一个停留留时间较短（约30min）的曝气池和沉淀池构成。工艺中采用空气混合絮凝反应和污泥回流，利用外加的化学混凝剂和污水中的天然生物絮凝剂，将化学混凝处理与生物絮凝强化处理相结合，充分发挥生物的絮凝吸附作用以及化学混凝对颗粒状和胶体状物质的去除作用，试验中应用PCR－DGGE技术对化学生物絮凝工艺及化学混凝反应器中微生物种群进行了初步的比较分析。1.试验材料和和方法1.1样品品的采集及预预处理：污泥泥样品取自上上海安亭污水水处理厂国家家“863”计划课题污污水处理中试试装置（以下下称化学生物物絮凝处理工工艺及化学混混凝处理工艺艺）（见图1），化学生生物絮凝处理理工艺中曝气气池采用微孔孔曝气管曝气气，分三段推推流回转式布布置，阶梯式式速度梯度变变化，每段可可独自调节曝曝气量以改变变速度梯度。化化学混凝采用用机械搅拌，分分三格推流式式布置。两反反应器中加药药量为：PAFC70mg··L-1。取样条条件以及运行行参数见表1。图1化学生物物絮凝、化学学混凝处理工工艺中试装置置图（50t·d-1）Fig1Thepiilotpplant((50t/dd)inShangghaiAAntinggwasttewateertreeatmenntplaant表1取样位置置和条件Table11Theeposiitionssandproceesscoonditiionsfforsaamplinng取样装置进水化学生物絮凝污污水处理中试试装置化学混凝污水处处理中试装置置取样位置------化学生物絮凝反反应池一、二二、三廊道化学混凝反应池池一、二、三三格样品名称Sample1Sample2,33,4Sample5,66,7运行情况DO(mg·LL-1)------一、二、三廊道道分别为3.7、3.1、1.7--------pH------6.9～7.336.8～7.553絮凝剂------投加聚合硫酸铝铝铁70mgg·L-1COD(mg··L-1)174.6264.8688.74NH3-N(mmg·L-1)14.5410.5411.62TP(mg··L-1)3.410.931.6样品预处理过程程见图2，化学混凝凝池样品取泥泥水混合物1000mml，其余步骤骤同进水。图2样品预处理理过程Fig.2Thhepree-treaatmenttoftthesaample1.2DNNA提取：方法及及试剂见文献献3-6。提取到的总DNA用0.5％的琼脂糖糖凝胶电泳（琼琼脂糖1g，0.5×TTBE缓冲液100mLL,电泳缓冲液液为0.5×TTBEbuuffer）进行检测，在在紫外灯下观观察拍照。电电泳所用Markeer为宝生物工程程（大连）有有限公司生产产的λ-HinddⅢdigeest。1.3PCCR引物及程序序、PCR产物浓缩：：见表2，PCR产物用1％的琼脂糖糖凝胶电泳进进行检测，在在紫外灯下观观察拍照。电电泳所用Markeer为宝生物工程程（大连）有有限公司生产产的DNAMMarkerrDL20000。表2试验中所所用PCR引物及条件件]Table11PCRRprimmersaandcoonditiionsuusediinthiisstuudyPCR引物P15`-ATTTACCGCCGGCTGGCTGG--3`P25`-CCGCCCGGCCGCGGCGCGGGCGGGCCGGGGCCGGGGGGCACGGGGGGGCCCCCATACCGGGAGGGCAGCCAG-3``PCR扩增程序序94℃预变性22min94℃，45ss裂解共30cyclles72℃延伸100min60℃，45ss退火72℃，90ss延伸PCR反应体系系无菌ddH22O39μL，10×PCCRbufffer55μL，2.5mmmol·L-1dNTP溶液1μL，10mmmol·L-1引物P1、P2各1μL，Taq酶1U，样品DNA溶液2μL合并6管PCRR产物，用Paarafillm膜封口口，-70℃冷冻过夜，取取出后用冷冻冻干燥机抽干干4小时，将得得到的干粉溶溶解于30μLddH2O中,-20℃保存。1.4DGGGE条件：PCR产物进一步步用DGGE（变性梯度度凝胶电泳）分分离，仪器为为DcodeeTMSysstem(bbio-RaadLabboratoories))。凝胶变性性梯度30%～60%，聚丙烯酰酰胺浓度8%，厚1mm，电泳缓冲冲液为0.5×TTAE]，电压150V，60℃，电泳时间4h。在含溴乙乙锭（0.5mgg·L-1）0.5×TTAE缓冲液中染染色后，在紫紫外灯下观察察拍照。1.5生物物多样性分析析分析出DGGEE图谱的密度度曲线后（SmarttView软件），利用Shannnon多样性指数数计算样品的的生物多样性性，Shannnon多样性指数数计算公式如如下：其中：H-Shhannonn多样性指数数；ni-第i个条带的峰峰高值；N-密度曲线中中所有峰高之之和。1.6污泥样样品显微镜观观察取污泥样品，在在Leica显微镜下观观察并拍照。2结果与讨论论2.1污泥样样品总DNA提取结果从样品中提取的的总DNA通过0.5％的琼脂糖糖凝胶电泳检检验，通过SmarttView软件分析提提取出的DNA片段大小约约为23kb，样品浓度度计算结果列列于表2。表2样品DNNA浓度Table22TheeconccentraationofexxtracttedDNNA样品1234567DNA浓度(uug·L-1)0.1222832410269.68.77.5从表2可以看出出化学生物絮絮凝反应体系系中DNA含量（样品2，3，4）约为化学学混凝池体系系中（样品5，6，7）的20-1000倍左右，这这说明在前者者的反应体系系中存在含量量较高的微生生物；另外从从表1可以看出，在在投加相同剂剂量的絮凝剂剂时，化学生生物絮凝工艺艺对污水当中中污染物的去去除表现出更更高的去除率率，由此可以以初步判断，在在化学生物絮絮凝工艺中，微微生物的存在在及其作用是是比较明显的的，但微生物物对污染物的的去除途径究究竟是以生物物降解还是生生物吸附为主主则有待于更更深入的研究究。2.2PCRR扩增结果取2μLDNNA样品作为模模板，进行PCR扩增，产物物经1%的琼脂糖凝凝胶电泳检验验，经SmarttView软件分析，扩扩增得到的DNA片段大小为220bp左右，为要要扩增的目的的片段。2.316SSrRNAA基因片段段PCR扩增的的DGGE结果果图3是经分离的的16SrrRNA的DGGE图谱谱，图中亮度度明显的条带带较少，同时时也由于存在在较多的亮度度比较暗的条条带，导致图图谱中条带有有一定的模糊糊，这可能是是由于在活性性污泥样品中中，存在着数数量庞大的细细菌种类。图3扩增后样品品DGGEFig.316SSrDNAAsepaarateddbyDDGGEDGGE图谱中中条带的数目目和亮度并不不能完全准确确地反映微生生物群落中种种的数量和丰丰富程度。由由于rRNA操纵子的多多样性、异相相性，使得一一种微生物可可能会产生多多个DGGE条带[8-110]。另一一方面，部分分的16srrDNA序列并非总总是能做到“种”（speciies）之间的区区分，使得一一个DGGE条带可能会会代表几种具具有相同部分分的16srrDNA序列的种[111]。此外外，在模板DNA中，由于浓浓度的不同，使使得数量少的的序列扩增不不充分，在DGGE胶片中无法法看到相应的的条带，因此此DGGE图谱中仅仅仅反映了样品品中数量最丰丰富的DNA类型。由于16srrDNADDGGE存在的诸多多缺陷，由扩扩增16srrDNA序列得到的DGGE条带图谱而而计算的生物物多样性仅仅仅能作为一种种指示，而不不能作为衡量量生物多样性性的一个绝对对指标[122]。参照进水样品，可可将图3中条带代表表的菌种大致致分为三类（见见表2）。表2样品菌菌种分类Table22ThecateggoryooftheebactteriainthheDGGGEproofile菌种种类典型条带化学生物絮凝池池化学混凝池与进水样品比较较，细菌数量量增加的Bandb,,c,f,hh,i,j,,kBandc,,f,g与进水样品比较较，细菌数量量变化不大的的Banda,,e,gBande与进水样品比较较，细菌数量量减少的BanddBanda,,b,d,ii,k在化学生物絮凝凝池中，与进进水样品比较较，细菌数量量增加的微生生物种类较多多，一方面这这是因为反应应器中30%的污泥回流流量增加了微微生物量，另另一方面也说说明这些细菌菌能够很好地地适应环境的的变化，甚至至可能还在进进行细菌的繁繁殖。比较样品1、55、6、7的DGGE图，可以看看出，化学混混凝池内的细细菌种类基本本与进水相一一致，这也符符合在化学混混凝池内没有有曝气供氧、没没有污泥回流流，其内微生生物主要来自自进水的原则则，也符合在在化学混凝池池内，污染物物如COD、SS、TP的去除，主主要来自化学学药剂引起的的絮凝作用，而而与微生物作作用无关。2.4样品多多样性指数分分析根据Shannnon多样性指数数公式进行计计算，结果列列于表3中。表3Shaannon多样性指数数计算结果Table33TheShannnonDiiversiityInndex样品1234567H1.821.701.671.641.731.711.70Shannonn多样性指数数H通常用于评评价一个微生生物种群内物物种的丰富性性，H值越高，微微生物种群越越丰富。多样样性指数通常常由两个因素素构成：①样品中物种种的数量或称称为种的丰富富度，②各个物种的的量的分布或或称为种的均均匀度。由表表3可以看出，进进水样品（样样品1）H值最高，这这是由于样品品1中（见图3）条带数目目较多而且优优势菌种较少少的结果。进进水样品中微微生物种群最最为丰富，各各种群数量分分布比较均匀匀，数量明显显占优势的菌菌种较少，在在环境发生改改变（氧气、添添加PAFC等）的情况况下，进水中中一些微生物物由于不能适适应而遭到淘淘汰，存活在在反应器中的的菌种则能够够很好地适应应反应器的条条件。2.5显微镜镜观察结果图4是对污泥样样品进行镜检检的结果（2000倍）。化学学混凝池的污污泥样品，絮絮体松散，颜颜色呈暗灰，是是典型的化学学污泥状态；；在化学生物物絮凝池第二二廊道的污泥泥样品中，观观察到有钟虫虫的存在，菌菌胶团呈活性性污泥的黄褐褐色，这更进进一步说明在在化学生物絮絮凝池中微生生物作用的存存在。图4-a样品品3显微镜观察察结果图4-b样品品6显微镜观察察结果Fig.4-aaThemicroographhofsaample3Fig.4-aaThemicroographhofsaample63结论在化学生物絮凝凝反应器中，微微生物多样性性相当丰富（表3），微生物种群结构也比较复杂。在化学混凝反应器中，微生物种类同样较为丰富，但数量与化学生物絮凝反应器比较则极少（表2）。结合表1的数据可以看出，化学生物絮凝池内由于生物作用的存在，使得其对污染物的去除率显著高于化学混凝池。对于化学生物絮絮凝池，进水水中的微生物物根据其在反反应器中浓度度的变化大致致可以划分为为三类：增加加、维持不变和和减少。图3中Bindb、c、i、j等条带所代代表的菌种，属属于优势菌种种，很有可能能是反应器中中生物作用的的主体。对两套反应器内内污泥样品的的显微镜观察察结果同样表表明，在曝气气且有污泥回回流的化学生生物絮凝池内内，微生物生生长状态较好好，明显不同同于化学污泥泥，有较好的的生物作用存存在。由于污泥样品成成分复杂，样样品中的痕量量重金属，盐盐类，均有可可能在样品的的DNA提取，PCR扩增，DGGE分离过程中中产生复杂的的影响，使得得利用PCR－DGGE分子生物学学技术对污泥泥样品的微生生物分析存在在一定的困难难，本文只是是进行了该技技术在污水处处理样品中的的初步研究，相相信随着研究究的深入，结结合常规的微微生物培养分分离、微生物物镜检等技术术，对环境微微生物进行研研究将会有较较好的发展前前景。参考文献[1]吴志平平，夏四清，扬扬殿海，高廷廷耀.化学生物絮絮凝工艺处理理城市污水比比较研究.重庆环境科科学，2003，25(7)：12–14[2]张智，邱邱维，张国庆庆.城市污水强强化一级处理理技术及发展展趋势.重庆环境科科学，2001，23(1)：46–49[3]萨姆布布鲁克J，弗里奇EF曼尼阿蒂斯T（金冬雁等等译）.分子克隆试试验指南.第二版.北京：科学学出版社，1996..919–929[4]陈灏，唐唐小树，林洁洁等.不经培养的的农田土壤微微生物种群构构成及系统分分类的初步研研究.微生物学报报，2002，42(4)：478–483[5]YLL

TsaiiandBH

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