叶绿素a的方法技术验证报告

分光光度法测定水中叶绿素 a分光光度法测定水中叶绿素 a的方法技术验证报告MHJ-02-19-03 MHJ-02-19-03 第#页共7页叶绿素a专业技术总结分析项目:叶绿素a分析方法:分光光度法验证人员:凌晨飞报告日期：2018年10日一、方法概述本方法依据HJ897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法。将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，

研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于 750nm、664nm、647nm和630nm波长处测定提取液吸收度，根据公式计算水中叶绿素 a的浓度。本方法适用于地表水中叶绿素 a的测定。二、 仪器和试剂仪器及设备过滤装置：HP-01真空泵和玻璃砂芯过滤装置。研磨装置：玛瑙研钵离心机：LDZ5-2型自动平衡离心机，相对离心力可达到1000Xg（转速3000r/min~4000r/min）。聚四氟乙烯离心管：15ml,旋盖材质不与丙酮反应。 （经实验该材质离心管对实验结果不产生影响）可见分光光度计：配10mm石英比色皿。针式滤器：0.45科m聚四氟乙烯有机相针式滤器。一般实验室常用仪器和设备。试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的去离子水或蒸储水。丙酮（CH3COCH3）。碳酸镁（MgCO3）丙酮溶液：9+1。（在900ml丙酮中加入100ml实验用水）。碳酸镁悬浊液。称取1.0g碳酸镁，加入100ml实验用水，搅拌成悬浊液（使用前充分摇匀）。WhatmanCATNO.1825-047玻璃纤维滤膜：直径47mm,孔径为0.7科m。三、试样的制备过滤：在过滤装置上装好玻璃纤维滤膜。根据水体的营养状态确定取样体积，富营养和中营养

过滤体积为100~200ml,贫营养过滤体积为5007000m1。用量筒量取一定体积的混匀样品，进行过滤，最后用少量蒸储水冲洗滤器壁。过滤时负压不超过 50kPa,在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镣子将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。研磨：将样品滤膜放置于研磨装置中，加入 3mh4ml90%丙酮（2.2.3）溶液，研磨至糊状。补力口3mh4ml90%丙酮（2.2.3）溶液，继续研磨，并重复1~2次，保证充分研磨5min以上。将完全破碎后的细胞提取液转移至聚四氟乙烯离心管（2.1.4）中，用90%丙酮（2.2.3）溶液冲洗研钵及研磨杵，一并转入离心管中，定容至10ml。浸泡提取：将离心管中的研磨提取液充分震荡混匀后，用铝箔包好，放置于 4c避光浸泡提取2h以上，不超过24h。在浸泡过程中要颠倒摇匀 2~3次。离心：将离心管放入离心机，以相对离心力 1000Xg（转速3000r/min~4000r/min）离心10min。然后用针式滤器过滤上清液得到叶绿素 a的丙酮提取液待测。空白试样的制备：用实验用水按照与试样的制备相同的步骤进行实验室空白试样的制备。四、分析步骤试样的测定：将试样转移至比色皿中，以90%丙酮溶液（2.2.3）为参比溶液，于波长750nm、664nm、647nm和630nm处测量吸光度。750nm波长处的吸光度应小于0.005,否则需重新用针式滤器过滤后测定。空白试验：按照与试样测定相同的步骤进行实验室空白试样的测定。五、结果计算与表示结果计算试样中口t绿素a的质量浓度（mg/L）,按照公式（1）进行计算：p1=11.85X(A664—A750)—1.54X(A647—A750)-0.08X(A630-A750) (1)式中：pi——试样中叶绿素 a的质量浓度，mg/L;A664—一试样在664nm波长下的吸光度值;A647A664—一试样在664nm波长下的吸光度值;A647—一试样在647nm波长下的吸光度值;A630——试样在630nm波长下的吸光度值;A750——试样在750nm波长下的吸光度值;样品中叶绿素a的质量浓度（pg/L）,按照公式（2）进行计算:p=（P1•Vi）/V （2）式中：p——样品中叶绿素a的质量浓度，Wg/L;pi——试样中叶绿素a的质量浓度，mg/L;Vi——试样的定容体积，ml;V——取样体积，L。5.2结果表示：当测定结果小于 100科g/L时，保留至整数位；当测定结果大于等于 100科g/L时，保留三位有效数字。六、方法检出限按照《环境监测分析方法标准制订技术指导》 （HJ/T168）附录A1.1.1方法确定检出限，测定含有浮游植物的地表水样品。按照样品分析步骤，对浓度值为估计方法检出限 2~5倍的样品进行7次平行测定，计算测定结果的标准偏差。 MDL=t（n-i,0.99）XS式中：MDL——方法^出限；n——样品的平行测定次数； t——自由度为n-1,置信度为99%时的t分布（单侧）；S-一n次平行测定的标准偏差平行号试样［11.85X(A664-A750)-1.54X(A647-A750)-0.08X(人63。—A750)W1/VS备注测定结果（g/L）15.6V1=10mlV=0.2L8=125.436.146.355.765.976.6平均值一乂（Wg/L）5.9标准偏差S1（科g/L）0.4t值3.143检出限（科g/L）1.3

测定卜限（g/L）5.2按照此方法当测定样品取样体积为 200ml时，测定的叶绿素a的方法检出限是1.3^g/L,测定下限是5.2pg/L。此方法检出限满足湖泊、水库营养状态评价分级标准限值的要求。七、方法精密度（1）将100科g/ml叶绿素a纯品分别取106、206、506加入空白的玻璃纤维滤膜 （2.2.5）中，按照样品分析的实际相同过程，研磨后定容至10ml（由于纯品叶绿素a溶解在90%丙酮中，丙酮溶解于水，所以全程序为研磨、浸泡、定容、离心、针式滤器过滤、比色。 ）每个样品平行测定7次，分别计算平均值、标准偏差、相对标准偏差。平行号试样［11.85x(A664-A750)—1.54X14的-A佃)—0.08X(Ae^—A750)M"b浓度（含量）1浓度（含量）2浓度（含量）3测定结果（科g/L）14.28.220.423.88.421.133.97.919.844.38.619.853.58.420.164.47.719.274.18.219.7平均值一X（科g/L）4.08.220.0标准偏差Si（〃g/L）0.30.30.6相对标准偏差％7.53.63.0（2）对实际样品精密度测定:对地表水样品进行精密度测定。水库水样采自高淳湖心，计算实验室内平均值、标准偏差、相对标准偏差。试样［11.85X(A664-A750)—1.54X(A647-A750)-0.08><(%一。)M"b高淳湖心18.0

测定结果（科g/L）28.537.447.958.868.277.6平均值"Xi（科g/L）8.1标准偏差Si（〃g/L）0.5相对标准偏差％6.2八、方法准确度对实际样品进行加标分析测试，在高淳湖心地表水样品中加入 100wg/ml的叶绿素a纯品在理论取样量为200ml情况下加入20小，实际加标叶绿素a的浓度为10科g/L。按照全程序每个加标样品平彳T测定7次。加标回收率=（加标试样测定值-试样测定值）+加标量X100%。测定结果如下表：编号1234567叶绿素a高淳湖心加标水样实际样品测定值（科g/L）8.08.57.47.98.88.27.6加标样品测定值（科g/L）16.817.215.916.217.416.915.9加标回收率（%）88.087.085.083.086.087.083.0加标回收率范围为 83.0%〜88.0%。九、总结按照本方法计算的方法检出限为1.3^g/L符合HJ897-2017的检出限为2dg/L;对浓度为5dg/L、10dg/L、25科g/L的叶绿素a纯品进行7次重复测定，实验室相对标准偏差分别是7.5%、3.6%、3.0%,符合HJ897-2017相对偏差W20%;加标回收率范围为83.0%〜88.0%,符合HJ897-2017加标回收