厌氧菌厌氧检测方法

-.z.厌氧培养检验方法厌氧菌只能在没有游离存在时才能生长繁殖，在有氧的环境中不能生长甚至死亡，所以在研究别离及鉴定时，必须在低氧化复原电势的厌氧环境中进展。根据物理、化学或两者结合建立起来的厌氧菌的培养方法很多。操作简单、要求相对低的培养方法有厌氧袋、疱肉培养基法、碱性焦性没食子酸法等，对厌氧环境要求高、操作复杂的培养方法有厌氧手套箱和Hungate技术。厌氧菌的培养基可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基液体培养基中含有复原物质，能够制造一个低氧化复原电势的厌氧环境，使厌氧菌能够很好的生长。使用液体培养基一般要在接种前煮沸培养基10min~15min,并急速冷却，立即接种，以便除去液体中的氧气，使氧化复原电势降到最低。液体培养基中有对流现象，容易使氧气进入，一般往培养基中参加0.05%~0.1%的琼脂，使对流降低到最小。对厌氧菌的初代培养，需培养48h后，进展初步观察，不生长的可转种平板进展观察。(一)疱肉培养基法疱肉培养基是一种最常用的厌氧菌液体培养基，培养基中的肉粒中含有谷胱甘肽和不饱和脂肪酸，谷胱甘肽是一种复原物质，能降低培养基中的氧化复原电势，不饱和脂肪酸可以与肌肉中的正铁血红素酶作用，吸收水中的氧，同时在培养基的外表加上液体石蜡和凡士林的混合物(约1:1),杜绝外界氧进入，从而造成一个无氧环境。接种时，先将培养基置于沸水浴中10min,除掉里面的氧气，冷却，再把试管放在火焰上，微火加热，使培养基上层的石蜡凡士林层融化，冷却到不烫手(约46℃),然后用接种环或无菌滴管接种。接种后，试管直立在试管架上，石蜡凡士林层凝固封住液体培养基的外表，置培养箱中培养，而对刚灭菌的新鲜疱肉培养基可先接种后再用石蜡凡士林封闭液面。对*些严格的厌氧菌，接种的疱肉培养基要先放在厌氧罐中，再培养效果更好。(二)凡士林隔绝空气法在试管内装入二分之一体积的液体培养基，灭菌处理后再放入沸水中煮沸5min,彻底除去培养基内的氧气，把少量无菌融化的凡士林注入液体培养基的外表，并使之迅速冷却，隔绝外界的空气。接种时，只需融化上面的凡士林，再用无菌毛细管导入菌液即可。此法不适合产气的厌氧菌，因产气厌氧菌产生的气体会破坏凡士林层。固体培养法(一)高层琼脂柱法此法很简单，只需把含有1%葡萄糖的琼脂培养基装至试管的三分之二高度，冷却凝固后，用接种针穿刺接种至琼脂底部，培养后厌氧菌在底部生长，越接近外表越差。也可在灭菌后冷却至45℃左右的琼脂中，直接用无菌吸管参加适量的菌悬液，然后迅速用两手搓转式管使之混匀，再放入冷水中使之凝固。培养后厌氧菌会在管的深处出现。(二)黄磷法在能密封的玻璃容器的底部放少量的水和一块搁板，培养皿或试管接种完后用纸包好放于搁板上。在容器的上部放一个无菌培养皿，把碳酸钙和黄磷放于皿中，用烧红的接种针引燃黄磷后，立即封闭容器。黄磷燃烧消耗掉容器中的氧，形成无氧环境。生成的氧化磷可被水吸收，1L的容积需用1g黄磷。(三)厌氧罐法1.厌氧罐体的构造目前使用的厌氧罐的罐体采用透明聚碳酸酯硬质塑料或不锈钢制成。圆形罐盖的周边凹槽内嵌有橡皮圈，能使罐体和盖密封。罐体与罐盖之间有一个大的金属螺旋夹，可使罐体密闭。罐体内盖的正中下方，有个金属丝网盒或金属盘，用于放催化剂。2.厌氧罐的原理原理是用物理或化学的方法把密闭容器中的氧除去，制造一个无氧环境。常用的方法是油气换气法和气体发生袋法。抽气换气法：先把需厌氧培养的平板或液体瓶放入真空厌氧缸或厌氧罐中，再放入钯粒催化剂(可使罐中的氧与氢反响生成水，除去氧)和美蓝指示剂(缸中有氧时，指示剂为蓝色，缸中无氧时，指示剂变无色),然后利用真空泵对真空厌氧缸或厌氧罐抽真空，再反复充入无氧的氮气3次，最后充入80%的氮气、10%的氢气和10%二氧化碳的混合气体。钯粒能够促使混合气体中氧反响掉，美蓝指示剂显示无色，则厌氧环境形成。钯粒催化剂用过后，经干热2h后可重复使用。翻开观察培养物后需重新抽气换气。该法的特点是只利用化学方法造成无氧环境，简便易行。该方法是在厌氧罐中放一个氢气、二氧化碳气体发生袋、催化剂、美蓝指示剂。在钯粒催化剂的作用下，罐中的氧气和氢气反响生成水，从而造成罐内的无氧环境。气体发生袋是由一丸硼氢化钠氯化钴合剂、一丸碳酸氢钠柠檬酸合剂及一片滤纸条组成。使用时剪去指定局部的一角，参加10mL水，水沿滤纸渗到两个试剂丸上，发生反响，产生氢气和二氧化碳。使用时，加水后应立即放入罐中并密闭，即可厌氧培养。(四)培养箱法对高度厌氧菌的培养，用上面的介绍方法难以到达要求，需使用专门的厌氧培养箱。厌氧培养箱内充满氮气、氢气、二氧化碳的混合气体，通过箱上带的橡胶手套，可以使所有的操作都能在箱内进展。(五)氧化酶法和氧化酶平板法氧化酶法是在氧化酶平皿中，先将0.1ml.的氧化酶参加到5mL的肉汁培养基中，再倒入厌氧培养基混合，当培养基处于融化状态时即参加厌氧菌。因皿盖内有一个内环，它与平板外表形成一个结实的密封环境，氧化酶可复原培养基中琼脂外表和盖子之间的空间氧。氧化酶平板法是先在氧化酶平皿中放入传统的厌氧培养基和少量的氧化酶制剂制成平板，使用时，直接进展划线接种，在有氧的条件下培养即可。(七)焦性没食子酸法1.

Wright管法Wright管法(见图4-2)可用于严格的厌氧菌培养。原理是焦性没食子酸与氢氧化钠溶液反响，吸收斜面与棉塞间的氧气。方法是在Wright管的斜面上划线接种厌氧菌后，将培养管口的棉塞修剪后用玻璃棒推入管内，使它刚好在斜面的上方，再在棉塞的上方和管口空间内填焦性没食子酸结晶，再参加1ml10%氢氧化钠溶液，最后在管口塞上橡皮塞，立即倒置，放于培养箱中培养。2.Buchner管法Buchner管是一个厚壁的玻璃管，它的下端变细，使装入的试管不能到达底部，管口有橡皮塞可使管密封培养时先在管的底部参加少许的焦性没食子酸，然后参加氢氧化钠溶液和接种好的试管，立即用橡皮塞封住管口，再放入培养箱培养即可。焦性没食子酸和氢氧化钠的用量是100mL的容积用1g焦性没食子酸和5mL20%氢氧化钠溶液。3.枯燥器法真空枯燥器的构造如图4-3,在隔板下放一个培养皿底盖，盖中参加5ml.10%氢氧化钠(或2.5ml.20%氢氧化钠或50%过饱和氢氧化钠),在盖上方放置一块载玻片，玻片上放0.5mg焦性没食子酸。把需要培养的试管(或培养皿)和一瓶美蓝试剂放在隔板上，然后盖上枯燥器的盖子(边缘涂抹少量的凡士林)上，密封好。稍微倾斜枯燥器，使焦性没食子酸与氢氧化钠混合，吸收氧气，同时翻开与枯燥器连接的真空泵，抽出枯燥器中的空气，即可放培养箱中培养。(八)除氧法Hungate厌氧技术Hungate厌氧技术是美国微生物学家R.E.Hungate于1950年发明的一套用于厌氧菌分离和培养的严格的厌氧技术，它包括培养基预还原和在无氧环境中进行的菌株分离和培养操作技术。除氧法Hungate厌氧技术的原理是利用除氧铜柱制备高纯氮，来驱除小环境中的空气，使整个操作过程从培养基的配制、分装、灭菌，以及菌悬液的稀释、接种、培养、别离、移种至保蔽笙却外干高度无氧的条件进展，从而保证严格厌氧菌的存活和生长。1.铜柱除氧系统的原理铜柱是由内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管构成，长约40mm~400mm,两段被加工成漏斗状，外壁绕有加热层，通过与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端用胶管一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。当从气钢瓶出来的气体如氮气、二氧化碳和氢气等含有微量氧气时，这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量氧气化合生成氧化铜，而氧化铜又被复原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。2.预复原培养基及稀释液的制备先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱除氧气，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5mlL~5mL,稀释液装9ml,同时插入通氮气的长针头以排除氧气，直至培养基内参加的氧化复原指示剂-刃天青由蓝到红最后变成无色，证明试管内氧气已被完全去除，再盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌。3.样品不同稀释度的制备在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，而后参加按此操作方法依次进展10倍系列稀释，制成不同浓度的样品稀释液。选适宜的三个稀释度进展试管培养计数。4.厌氧滚管培养法将盛有无氧无菌琼脂培养基的试管加热至100℃，使琼脂熔化，并保温在50℃左右的水浴中，备用。用无菌注射器取至少3个稀释度的样品稀释液0.1mL,参加盛有融化的预培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。适温培养后，在琼脂层内或外表形成肉眼看见的菌落。移种挑取单菌落时，将带有单菌落的试管和需接种的盛有无菌、厌氧培养液的试管固定在适当的支架上，去掉试管的胶塞，同时插入用火焰灭过菌的注射器氮气长针头，通入气流速度适当的、无菌的高纯氮气。将挑菌落的无菌弯头毛细管的粗口端接一约60cm长的乳胶管，小心插入形成单菌落的试管内，用嘴咬住胶管的另一端，轻轻吸取待取的单菌落，转移至盛有厌氧培养液的试管内，塞上胶塞，拧紧螺口胶木盖，适温培养。5.活菌〔别离〕计数选择分散均匀，数量在几十至几百个菌落的厌氧试管进展活菌计数，即可得出每克或每毫升样品中含有的厌氧菌的数量。6.计算活菌数量CFU/g(mL)样品=0.1ml滚管计数的实际平均值*10*稀释倍数。最方便、快捷、广泛的是厌氧产气袋方法，只需把药剂(产气袋)外包装剪开放入袋(盒或罐)内(见下列图),密封后即可形成适宜的厌氧环境。药剂袋分厌氧培养、微需氧培养和嗜二氧化碳培养三种类型。完全厌氧可同时放置指示剂。此法操作更加简便，不用加水、不用催化剂。厌氧产气袋反响30min后氧气浓度降为0;微需氧产气袋反响后到达氧气浓度8%-9%,二氧化碳浓度7%~8%;二氧化碳产气袋反响后到达氧气浓度15%左右，二氧化碳浓度6%左右。2.5升3.5升系列安宁包〔AnaeroPack〕厌氧产气袋C-110只/包264元/包用于完全厌氧菌培养，配套C-31或者C-43使用，规格2.5升微需氧产气袋C-210只/包273元/包用于微需氧菌培养，配套C-31使用，规格2.5升二氧化碳产气袋C-310只/包264元/包用于嗜二氧化碳菌培养；配套C-31使用，规格2.5升厌氧产气袋C-3510只/包353元/包用于完全厌氧菌培养，配套C-32或者C-43使用，规格3.5升350毫升系列安宁包〔AnaeroPouch〕厌氧产气袋C-1110只/包202元/包用于完全厌氧菌培养，配套使用15×30cm培养袋，规格350ml氧气指示剂〔O*ygenIndicator〕氧气指示剂C-2210只/包86元/包厌氧培养监测专用；1只/次，可重复使用4-5次培养容器2.5L密封培养罐C-311只/包715元/只配套用2.5L安宁包1只，规格19.7×13.5×9.5cm，能容纳10-12只9cm皿7.0L密封培养罐C-321只/包1048元/只配套用3.5L安宁包2只或2.5L3只，规格28.0×21.3×11.2cm，36-42皿1