DB21-T3698-2023饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测

ICS65.12021CCSB4621辽 宁 省 地 方 标 准DB21/T3698—2023饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测MethodfordeterminationofClostridiumbutyricuminfeeds20232023022820230328辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3698DB21/T3698—2023DB21/T3698—2023DB21/T3698—2023目 次范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1缩略语 1稀释液、培养基及试剂 1设备和实验器材 1检验程序 2采样 3试样的制备 3操作步骤 3确证试验 4结果计算与报告 5附录附录A（规范性）培养基和试剂 7附录B（资料性）细菌DNA提取 9I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。。我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。2242347862。9号，联系电话IIII饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测范围本文件规定了饲用微生物制剂中丁酸梭菌的检测方法。本文件适用于各种饲料添加剂各组分中丁酸梭菌的检测。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T4789.2食品微生物学检验菌落总数测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。FTG FluidThioglycollate，液体硫乙醇酸盐5稀释液、培养基及试剂0.85%灭菌生理盐水。AA.1。AA.2。细菌生化鉴定试剂盒。DNACICC10390。实验室用水:GB/T66826设备和实验器材16.1恒温培养箱：37℃±1℃。漩涡震荡器：0～2800rpm。显微镜：10006.4高压灭菌锅：105～134℃。无菌玻璃或塑料培养皿Φ=90mm。250mL。无菌玻璃或塑料涂布棒。无菌吸管：1mL（0.1mL）10mL（0.5mL）。微生物鉴定仪。6.10电子天平：感量为0.1g、0.01g、0.0001g。4pH0.1。量筒：250mL。PCR电泳仪。电泳仪。凝胶成像仪。10μL、100μL、1000μL、10000μL。7检验程序丁酸梭菌检验程序见图1。2图1丁酸梭菌检验程序8采样菌器皿。采样后，样品应及时送至微生物检验室进行检测。采样数量和方式按照GB/T14699.1执行。9试样的制备按照GB/T20195进行。菌器皿。采样后，样品应及时送至微生物检验室进行检测。采样数量和方式按照GB/T14699.1执行。9试样的制备按照GB/T20195进行。10操作步骤检样制备与稀释以无菌操作取试样25g(mL)，注入盛有225mL0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中，均质1min～2min或置振荡器中振荡30min，制成1︰10的初始菌悬液。吸取1︰10的初始菌悬液1mL，加入9mL0.85%灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1︰100的稀释液。根据样品含菌量，按上述操作顺序做进一步的10倍系列递增稀释的稀释度。接种和培养选择2个～3个适宜稀释度，每个梯度3个平行，用无菌移液器分别吸取0.1mL稀释液，接种到改良FTG7.0±0.215℃培养箱中厌氧培养24h±1h。菌落计数及筛选3培养后，选取菌落数在30个～300个之间的平板计数，若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。培养后的平板内的培养基颜色由粉色变成淡黄色，典型丁酸梭菌菌落形态呈端圆，白色，稍凸，不透明，表面菌落稍有不规则。确证试验菌种制备自平板上挑取单菌落，划线转接培养于丁酸梭菌改良FTG平板上，37℃±1℃严格厌氧培养24h±1h，从平板上选取至少5个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。形态观察生化确认试验表1丁酸梭菌生化特征PCR表1丁酸梭菌生化特征PCRDNA用商用细菌基因组DNA（附录提取试样扩增引物序列上游引物：F5′-CTTTATTTGGAGTAGCACCT-3′；4特征结果特征结果乳糖+蜜二糖+水杨苷+松三糖-木糖+棉子糖+山梨醇-鼠李糖-淀粉水解+明胶水解-注：+：阳性；-：阴性。下游引物：R5′-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3′。PCR反应体系如表2所示。预计扩增产物大小为171bp。PCRPCR反应体系见表2。2PCR试剂使用量（μL）2×TaqMasterMix5上游引物（20μM）0.5下游引物（20μM）0.5模板（100ng/μL）1ddH2O3总体积10程序设定530℃30s30s；⑤保温：4℃10min。步骤②至④的循环数设为35。电泳用电泳缓冲液(1×TAE)制备1.0%琼脂糖凝胶，加入Gelred染料。取5μLPCR扩增产物，进行点样。用DNA分子量标记物做参照。3V/cm～5V/cm恒压电泳，电泳30min，电泳检测结果用凝胶成像仪记录并保存。确证结果171bp171bp12结果计算与报告12.1菌落计数只计算符合10.3的菌落。5g（mL）样品中的菌数，按式（1）计算：A=B×C׃ (1)5式中：5A—测定的丁酸梭菌菌落数，CFU/g(mL)。B—丁酸梭菌的可疑菌落总数。C—5个鉴定的菌落中确认为丁酸梭菌的菌落数。f—稀释倍数。最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例：含有丁酸梭菌的样品中106稀释液在培养基平板上，生成的丁酸梭菌可疑菌落为100个，取5个鉴定，证实为丁酸梭菌的是4个，由1g饲料中含丁酸梭菌菌数为：100×4×106=8.0×107CFU/g512.2样品中丁酸梭菌菌数的计算方法与报告（30个～300个之间），通过式（2）计算，即为1mL或1g样品中的丁酸梭菌菌数N：N= 5� (2)Vn1+0.1n2d式中：N 样品中丁酸梭菌菌落数；∑a 所有平板经确证后的丁酸梭菌菌数的总和；V 平板的接种体积，单位为毫升（mL）；n1 第一个稀释度的平板数；n2 第二个稀释度的平板数；d 第一个稀释度的稀释因子（d）。按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可将样品的丁酸梭菌菌落数记录为1.0--9.9乘以10的指数幂表示。报告每mL或每g样品的丁酸梭菌估计数，单位CFU/g（mL）。示例1：若第一个稀释度（10-4）经确证后的菌落数为137和201，第二个稀释度（10-5）经确证后的菌落数为34和56，则：N=式中：

= 428137+201+34+560.1×2+0.1×2×10−4137+201+34+560.1×2+0.1×2×10−4

=19454545按照GB/T8170数值修约规则得出每克或每毫升样品中含丁酸梭菌估计数为19454545或.907FUgL。示例2：（052135，则：N=121+1350.1×2×10−5

= 2560.000002

=128000000式中：按照GB/T8170数值修约规则得出每克或每毫升样品中丁酸梭菌估计数为128000000CFU/g（mL）或1.3×108CFU/g（mL）。6附录 A（规范性）FTG成分胰蛋白胨 15g酵母粉 5g葡萄糖 10g硫代乙醇酸钠 3gL-半胱氨酸盐酸盐 0.5g氯化钠 2.5g琼脂 20g刃天青 0.001g蒸馏水 1000mL制法将上述成分加于蒸馏水中，调pH值至7.0±0.2，加热煮沸，121℃高压灭菌15min。革兰氏染色革兰氏染色结晶紫染色液成分结晶紫95%乙醇1%草酸铵水溶液1g20mL80mLA.2.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液成分碘碘化钾蒸馏水gg300mLA.2.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.2.3沙黄复染液7成分沙黄 0.25g95%乙醇 10mL蒸馏水 90mL制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.2.4染色法11s，水洗；滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。88附录 B（资料性）DNADNA细菌培养细菌接种于5mL液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过夜。细菌收集取1mL培养物于1.5mL无菌EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mLTEH.0中或dO菌体裂解加入6μL50mg/mL的溶菌酶，372h。再加2mol/LNaCl50μL，10%SDS110μL，20mg/mL的蛋白酶K3μL，50℃作用3h或37℃过夜（此时菌液应为透明粘稠液体）。抽提10min，12000rpm离心10min