有机化合物和药物结构分析中的核磁共振技术

薛思佳柯少勇核磁共振（NMR）是一种用来研究物质分子结构及物理特性的光谱学方法，它经历了从1960年代的连续波（continuouswave,CW）技术到1970年代的脉冲傅里叶变换（pulsefouriertransform,PFT）以及超导核磁共振等几个发展阶段。尤其是近年来脉冲傅里叶变换以及超导核磁共振的引用，提高了核磁共振谱仪的灵敏度，使核磁共振技术在微量分析方面得到广泛应用。大型高速计算机的发展和应用使二维和三维核磁共振技术得到长足的发展，成为科技人员不可缺少的结构分析工具。早期NMR技术的应用仅局限于物理学领域，主要用于测定原子核的磁矩等物理常数。1950年代，普罗克特（W.G.Proctor）等人发现处在不同化学环境的同种原子核具有不同的共振频率，即化学位移。接着又发现相邻自旋核会引起核磁共振谱的分裂，即自旋-自旋耦合。这一切开拓了NMR技术在化学领域中的应用。1966年，瑞士科学家厄恩斯特（R.R.Ernst）发明了脉冲傅里叶变换NMR，将NMR仪器和技术推向一个崭新的高度，并因此于1991年获得诺贝尔化学奖。1990年代，超高场核磁共振谱仪的问世，极大地提高了检测的灵敏度和分辨率，加之NMR与计算机科学的完美结合，二维和三维NMR、固体高分辨NMR、液相色谱-核磁共振联用（LC/NMR）等新技术如雨后春笋般不断涌现，使NMR成为理论严密、技术先进、结果可靠、独立的物质结构分析方法，被广泛应用于药物有机分子结构确证、蛋白质三维结构研究、物质科学的固体成像，以及临床医学疾病诊断等领域。NMR在药物发现和药物结构分析中的应用就本质而言，核磁共振谱与红外和紫外吸收光谱一样，是由物质与电磁波相互作用而产生的，属于吸收光谱范畴。根据核磁共振谱图上共振峰的位置、强度和精细结构就可以研究物质的分子结构。药物发现是合成新化合物、确认其结构和发现生物活性的全过程。其中，新化合物主要来源于两种途径：一种是从天然产物中提取活性物质，另一种是人工化学合成。不管由哪种方法获得新化合物，接下来要做的首要工作就是确证该化合物的分子结构。一般未知物的NMR解析步骤如下：（1）做出13C谱，确定碳的总数；（2）做出碳分类谱（DEPT），确认伯、仲、叔、季碳，确定碳的骨架单元；（3）做出13C-1H相关谱（HMQC），确认各碳上可能存在的氢；（4）做出1H-1H化学位移相关谱（TOCSY），找出各氢之间的链接及耦合关系，确定可能的结构单元；（5）做出异核多键远程相关谱（HMBC），将可能的结构单元相连接；（6）做出空间效应谱（nuclearoverhausedeffectspectroscopy，NOESY），充分考虑分子结构的空间效应，精确连接结构单元；（7）对分子结构进行全面确认。对确定一个未知物的分子结构来说，最重要的有两个谱：碳分类谱（DEPT）和13C-1H相关谱（HMQC）。DEPT谱是一种不失真的最好的极化转移增强与谱编辑技术，主要用于有机物结构测定中增强碳谱的灵敏度，并对属于伯、仲、叔和季碳的NMR信号进行分类，从而确定碳原子级数。DEPT谱包括三个子谱：DEPT-45、DEPT-90和DEPT-135谱。而HMQC谱是异核多量子化学位移相关谱，它实现了13C和与之相连的质子的相关，即一键相关。有了以上两个谱图的重要信息，可以基本勾画出一个未知物的结构单元，再结合同核1H-1H化学位移相关谱（COSY）、异核多键远程相关谱和空间效应谱，就可全面准确地确证一个未知物的分子结构。

随着化学、化工、生化、制药等研究领域的迅猛发展，人们越来越关注蛋白质、天然及合成药物或其他天然产物等复杂分子的结构和构型。从1970年代起国际上发展了自旋-自旋耦合质子的二维NMR技术，即在同核1H-1H化学位移相关谱中，采用各种脉冲序列，在两个独立的时间域进行两次傅里叶变换得到两个独立的垂直频率坐标系的谱图。二维NMR大大提高了谱分辨率，清楚准确地反映出各种复杂分子结构中各种原子之间的链接、耦合及空间信息。二维核磁共振谱主要有三类谱图：J分解谱（即自旋耦合分解谱）、化学位移相关谱和多量子跃迁谱。其中化学位移相关谱（又称6-6谱）是二维核磁共振谱的核心，它表明共振信号的相关性。这其中共有三种位移相关谱：同核耦合、异核耦合和化学交换。在研究中可以通过相敏的1H-1H化学位移相关谱研究分子结构中各种氢的相关性，再通过灵敏度增强的异核位移相关谱，1H-13C相关谱实验以及带有梯度场脉冲的1H-13C异核远程相关实验来研究分子结构中碳与氢的互相键合与耦合关系，还可以通过空间效应谱实验来研究更为复杂的分子空间立体结构。1H-1H化学位移相关谱是全相关谱，在该谱中，可发现所有同为相同自旋体系部分的质子的交叉峰，这种技术的优势在于它可以在共振重叠的地方解释谱图，得到的信息在研究肽和蛋白质的结构时十分重要。13C-1H异核多量子化学位移相关谱实验和13C-1H异核多键远程相关谱实验也称为反向（inverse）实验，即通过采集1H的信号，显示13C-1H之间的相关信号；与它们相反的正向实验分别是二维异核化学位移相关谱（XHCORR）和长程耦合的异核位移相关谱（COLOC），是通过采集13C信号显示13C-1H之间的相关信号。反向实验由于是采集具有最高?酌值（旋核比）的1H信号，因此灵敏度比正向实验高很多。这种技术使得13C化学位移能够与那些相隔2〜3个键的质子的化学位移相关。空间效应谱主要反映了有机化合物结构中核与核之间空间距离的关系，而与两者间相距多少根化学键无关。其与同核1H-1H化学位移相关谱的重要区别在于交叉峰指出的是在空间上相互接近的质子，即它给出的线索是通过空间，而不是通过键的相互作用，因此对确定有机化合物结构、构型和构像以及生物大分子构像（如蛋白质分子在溶液中的二级结构等）有着重要意义。在2002年，意大利科学家巴尼（E.Barni）等人利用二维核磁技术中的空间效应谱（1H-1HNOESY）系统分析了苯并咪唑类衍生物的分子结构。在该类化合物分子中位于环上不同位置的氢原子其所处的化学环境可能并不相同，在进行结构鉴定时，使用简单的一维核磁共振技术无法准确分辨它们，但使用二维NMR技术中的空间效应谱就可以对该类化合物进行很好的结构认证。利用二维NMR技术，结合计算机模拟，还可以测定生物大分子在溶液中的三维空间结构，研究蛋白质折叠机制及动力学过程、酶催化过程、蛋白质和核酸的相互作用、药物同受体的相互作用等。近年来，二维NMR还被用于研究系列定位突变体的结构和功能变化三维NMR三维NMR谱与结构生物学有机化学、药物化学和生物化学的发展要求人们必须在三维空间上了解分子的结构和性能，尤其是与生命过程有关的化学问题。如药物分子的立体构型与受体之间的相互作用，生化反应过程的立体选择性和分子的立体构型之间的关系，各类天然有机化合物的立体构型与它们表现出的生物活性之间的关系等，这类问题导致了三维NMR技术的产生与发展。三维NMR技术是二维NMR技术的发展，它主要用于测定生物大分子，尤其是蛋白质的三维结构。通过肽把一个氨基酸残基上的1H磁化矢量转移到另一个氨基酸残基，再用三维NMR方法进行序列归属。该方法的精确性可与晶体的X射线衍射成像相媲美，而其优越性则在于测定的是溶液中的结构，从而可以研究蛋白质发挥功能的动力学过程。三维NMR技术也广泛应用于天然有机化合物（天然产物）绝对构型的测定，从而为进一步测定其生物活性提供了一定的依据。高分辨NMR技术高分辨NMR技术包括交叉极化魔角旋转（CP-MAS）和高分辨魔角旋转（HR-MAS）技术。这两项技术最适宜测定固体和具有部分流动性的固体。迄今为止，进行核磁共振谱测定时，通常要将样品先制成溶液然后再进行测定。固体样品的核磁共振谱分辨率很差，这是由于固体分子不能自由运动，13C核在外磁场中有各种取向，造成吸收峰很宽（各向异性宽峰）的缘故。针对固体化学位移的各向异性以及自旋晶格驰豫时间很长的缺点，采用交叉极化魔角旋转技术，通过使样品在旋转轴与磁场方向夹角为54.7。的方向上高速旋转以及交叉极化等方法，使上述不足之处得以顺利解决。高分辨魔角旋转技术可以对一些具有部分流动性的物质进行结构研究。当样品具有一定的流动性时，虽能平均掉相当一部分固体性质所造成的各向异性，但仍不能达到像液体样品那样的高分辨率。此时，应用高分辨魔角旋转可以平均掉剩余线宽而使谱线变窄，从而获得接近液体样品的线宽。这些方法在活体样品和生物组织的结构研究中具有独特的优势，同时也被广泛应用于材料科学、矿物分析、表面吸附、聚合体陶瓷以及组合化学等研究领域。美国布鲁克公司核磁应用部曾分别利用400兆赫和800兆赫场强的核磁共振仪对狗的血样进行了比校分析。理论上后者测试结果的分辨率应远远高于前者的，但由于在用400兆赫场强的仪器测试时运用了高分辨魔角旋转技术，而在800兆赫场强的仪器测试中仍然使用常规技术，结果发现采用了高分辨魔角旋转技术的实验结果比高场强核磁共振仪的测试结果分辨率更高。该项研究表明高分辨核磁共振技术在流体样品和生物组织结构研究中确实具有独特的优势。磁共振成像与疾病诊断自从1973年劳特伯（P.C.Lauterbur）在世界上首次发表关于实现磁共振成像（MRI）的论文以来，这个跨物理学、无线电电子学、计算机技术以及应用数学的边缘学科，无论是发展规模还是发展速度，都处于核磁共振领域的首位。随着二维、三维NMR的发展，人们很快认识到NMR成像对研究人和动物解剖具有巨大潜力。由于水含量和驰豫时间的差异，利用适当的NMR脉冲序列就可以区别不同的生物组织，获得有明显差异的正常和病理组织的图像。作为临床许多疾病的诊断工具，其安全性和准确性远优于其他成像技术，如计算机轴向体层摄影（CT）。而最让人兴奋的是基于顺磁去氧红细胞的磁敏感效应来研究局部大脑功能。科学家们应用NMR连续监测大脑运动中枢部位的图像变化，以确定该区域的功能，从而为研究人脑深层次的思维活动开辟了一片新天地，给脑功能研究带来了福音。核磁共振成像的方法很多，主要有自旋密度成像、化学位移成像及弛豫时间T1和T2加权成像。近年来，快速成像技术已基本解决。迄今已出现的几十种快速成像技术中，最快的可以平均50毫秒成一幅图像的速率不断扫描人体，克服了长期以来由于速率太慢而无法直接扫描人体心脏及研究某些动态过程的困难。最近扩散（diffusion）成像及灌注（perfusion）成像的理论与应用研究又成为新的热门领域。可以相信，随着NMR和计算机科学的理论与技术不断发展并日趋成熟，NMR无论在广度和深度方面必将出现新的飞跃性进展，并一定会在有