药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会

药品微生物限度与无菌检查

方法验证实验的要点及体会中国药品生物制品检定所马仕洪北京2007年1月website:tel/p>

地址：北京市天坛西里2号：1000502023/3/251一、方法验证实验的背景及程序1、关于方法验证〔背景〕2、方法验证实验的一般原那么和程序2023/3/2521、关于方法验证〔背景〕?中国药典?2005版国食监注〔2005〕234号“关于颁布和执行?中国药典?2005年版有关事宜的通知〞国药典发〔2005〕98号“关于执行?中国药典?2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明〞中检药〔2006〕862号“第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要〞2023/3/253为什么验证?1〕、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结果的科学性，如鉴别、含量测定。2〕、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多方面：无菌环境验证〔尘埃离子、浮游菌、沉降菌检测〕、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性对照、阳性对照等等。2023/3/254为什么验证?3〕、2005版充分借鉴发达国家经验，将微生物检查方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明〔验证〕，保证其对结果判断没有影响。4〕、有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判，以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以及新的药品注册管理办法的要求都是相一致的。2023/3/255为什么验证？5〕、验证的必要性〔质量控制的新手段〕：不同企业以及同企业不同批次黄连上清丸稀释法的回收率比较试验结果，可能反映了不同黄连上清丸样品的质量差异。2023/3/256表5七企业黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果Tab1Recoveryofdilutemethodinmicrobiologicaltestofhuanglianshangqingwanfrom7corporations2023/3/257表6同厂不同批黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果〔1：200〕

Tab2recovericeofdilutemethodinmicrobiologicaltestofhuanglianshangqingwanfromdifferentbatchsinsamecorporation(1:200)2023/3/2582、方法验证实验的一般原那么和程序验证什么？怎么验证？2023/3/259验证什么？微生物检验：某种样品采用某种方法得到一个检查结果。What？①供试品影响②方法的有效性2023/3/2510验证什么？需前处理不需前处理有抑菌作用无抑菌作用样品检查去除抑菌作用①验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。③验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。②可以通过验证实验判断

图1药品微生物检查方法验证的一般程序与环节What？2023/3/2511验证什么？

——需要验证的重点环节验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明〔验证〕，保证其对结果判断没有影响。前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在验证范围内。已有标准规程〔SOP〕和充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究提高。供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。2023/3/2512方法疑问实例——菌在何处？

金葡10-6大肠10-6铜绿10-6枯草10-5白念10-5黑曲霉10-4不离心菌悬液计数3923471393100离心管上部菌悬液计数252362182731离心管中部菌悬液计数272040154733离心管下部菌悬液计数302149122764表710ml菌悬液500r/min离心5min离心后离心管不同部位菌悬液的计数结果〔cfu/mL〕离心集菌法：500r/min离心5min×××r/min=×××g？2023/3/2513怎么验证？利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响，通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。How?2023/3/2514稀释法薄膜法中和法离心法供试品前处理去除抗菌活性稀释溶解分散萃取离心供试品污染微生物检查验证2023/3/2515供试品中抗菌活性的去除稀释法——降低供试品的相对浓度薄膜法——利用体积差异分离中和法——利用化学〔生物〕专属性灭活离心法——利用沉降系数差异分离各方法组合运用，效果更佳！2023/3/2516抗菌活性去除效果的检验应根据供试品的特点，选择敏感菌株，对供试品抗菌活性去除效果加以检验〔阳性菌的回收实验〕，再按药典要求全面验证，提高效率。2023/3/2517选择敏感菌株间接方法——文献、技术资料〔可靠〕直接方法——预实验〔体外抑菌实验〕参考选择：一般中药选择枯草和金葡；一般抗生素根据抗菌谱选择。

2023/3/2518药物名称生产企业大肠金葡枯草白念黑曲抗栓再造丸辽宁华鑫药业有限公司100454610095更年安胶囊福州金象中药药业有限公司87954110091清热安宫丸江西国药药业有限公司88141510092通宣理肺丸广东阳江制药厂10059100

100100肝德志胶囊四川省通阳制药厂936441100100宁心安神胶囊广西南宁万士达制药厂100<70<70100100防癌胶囊北京北卫药业有限公司3552<7010081肠胃舒胶囊北京北卫药业有限公司73224710086骨络通酒北京北卫药业有限公司10076110092消渴丸北京北卫药业有限公司9316710088鼻渊丸武汉中联药业集团公司80051100100陀螺银屑胶囊烟台中洲制药厂100<70<70100100冠心丹参胶囊内蒙古自治区包头制药厂8900100100龟龄集山西广誉远园药业有限公司100<70<70100100肚痛健胃整肠丸香港康恩堂制药厂83<70<70100100冠心丹参胶囊长春海王生物制药有限公司100<70<70100100糖尿乐胶囊哈尔滨中药六厂有限公司100<70<70100100降糖宁胶囊通化茂祥制药有限公司100<70<70100100温胃舒胶囊江苏聚荣制药有限公司<70<70<70100100表8

选择敏感菌株2023/3/2519二、方法验证实验的几个要点1、无菌检查法验证实验要点2、微生物限度检查法验证实验要点3、验证实验实例2023/3/25201、无菌检查法验证实验要点样品菌种和实验用菌液标准化操作实验器材2023/3/2521无菌检查样品无菌检查样品取样量〔量〕样品特性〔质〕抗菌活性剂型检验数量检验量侧重验证实验侧重无菌检查敏感菌选择去除抗菌活性方法选择前处理方法2023/3/2522无菌检查样品主要是取样量的问题?中国药典?2005年版对无菌检查的“检验数量〞和“检验量〞作了明确的解释和规定。2023/3/2523表2中上市抽验样品〔液体制剂〕的最少检验量供试品装量V(ml)每支样品接入每管培养基的最少样品量最少检验数量(瓶或支)≤11<V<55≤V<2020≤V<5050≤V<10050≤V<100(静脉给药)100≤V≤500V>500全量半量2ml5ml10ml半量半量500ml20*101010101066*每种培养基各接种10支供试品2023/3/2524表3中上市抽验样品〔固体制剂〕的最少检验量

供试品装量M/支、瓶或个每支样品接入每管培养基的最小样品量最少检验数量（瓶或支）

M<50mg50mg≤M<300mg300mg≤M<5gM≥5g外科用敷料棉花及纱布缝合线、一次性医用材料带导管的一次性医疗器具（如输液袋）其它医疗器具全量半量150mg500mg取100mg或1cm×3cm整个材料*3整个器具*3（切碎或拆散开）

20*1101010*21020*11020*12023/3/2525表3注释*1

：每种培养基各接种10支供试品。*2：抗生素粉针剂(≥5g)及抗生素原料药(≥5g)的最少检验数量为6瓶(或支)，桶装固体原料的检验数量为4个包装。*3

：如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。2023/3/2526无菌检查样品三点体会：一是附录规定检验量的表格中不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然容易忽略；2023/3/2527无菌检查样品三点体会：二是无菌检查时应强调“检验数量〞，主要是保证实验结果的代表性，而阳性对照实验和验证实验仅须满足“检验量〞总量要求即可，以检验样品对实验结果的影响，即保证实验结果的可靠性，验证实验可以由此减少大量的样品；

2023/3/2528无菌检查样品三点体会：三是对“检验数量〞和“检验量〞的把握应考虑便于实际操作，比如处理100ml/袋的样品，取9袋样品一次分配到一组三联滤器，“检验数量〞大于药典规定的6个，但“检验量〞似乎不符合药典规定的每袋样品取半量检验的规定，仅为1/3，但根据药典“检验量〞即为“一次实验所用供试品的总量〔g或ml〕〞的解释，这与先将6袋分配两个滤筒、再将剩下3袋抽入一个滤筒作为阳性对照的方法一样，却更节省时间。2023/3/2529菌种和实验用菌液枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[CMCC〔B〕63501]金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CMCC〔B〕26003]生孢梭菌Clostridiumsporogenes[CMCC〔B〕64941]铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC〔B〕10104]大肠埃希菌Escherichiacoli[CMCC〔B〕44102]白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC〔F〕98001]黑曲霉Aspergillusniger[CMCC〔F〕98003]2023/3/2530菌种和实验用菌液验证用菌种的保藏使用频繁传代限制〔5代〕2023/3/2531菌种和实验用菌液菌种保藏及应用参考方法：干菌种〔0代〕100ml液体培养基复苏〔1代〕100ml液体培养基复壮〔2代〕加100ml20%无菌甘油混匀，1ml/管冻存管分装，-20℃或-80℃保存每次使用取1支自然〔室温〕解冻，取接种至10ml液体培养基〔生孢梭菌用12ml硫乙醇酸盐流体培养基〕按规定培养、稀释〔3代〕注意：已经解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！2023/3/2532菌种和实验用菌液各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。2023/3/2533菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：取经34℃培养18-24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿假单胞菌与大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释备用〔枯草芽孢杆菌至10-5、金黄色葡萄球菌10-6、绿假单胞菌与大肠埃希菌至10-7〕；2023/3/2534菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-7备用；2023/3/2535菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：取经24℃培养18～24小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml，加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5备用；2023/3/2536菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：取经培养一周的黑曲霉菌改良马丁琼脂斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液5ml，洗下孢子，转移至另一空管，加0.9%无菌氯化钠溶液至与标准比浊管浊度相当后，取1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4备用。

2023/3/2537菌种和实验用菌液关于黑曲霉：

转种操作应在超净工作台〔或相当此环境〕中进行，关闭风机，靠近酒精灯操作；置23～28℃培养5～7日，培养斜面形态可参照以下图；转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121℃湿热灭菌30分钟再作处理；2023/3/2538菌种和实验用菌液关于黑曲霉：

黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于4℃0.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。2023/3/2539菌种和实验用菌液菌液检验：结合验证实验方法进行活菌计数。生孢梭菌可在同步硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度实验中计数。2023/3/2540标准化操作方法选择样品处理冲洗方法和条件中和剂加入菌液加入2023/3/2541标准化操作方法选择取样量大于5ml/支直接接种法不再适用；除非样品不许可〔难溶解〕，发展趋势应采用全封闭的薄膜过滤法。2023/3/2542标准化操作样品处理主要强调固体样品的溶解、转移、均匀分配问题。通常将规定取样量全部转移到400～500ml稀释剂或者适宜溶液，再进行分配。各厂家均专门开发有固体制剂〔粉针〕专用滤器，我们提出了更为简便的无菌三针单联管。

2023/3/2543标准化操作冲洗方法

强调少量多次：50ml/次；强调充分振摇；操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过程中盖还是不盖滤筒下口等等。

2023/3/2544标准化操作菌液加入菌液组、供试品加菌液组严格一致。

生孢梭菌的加入

2023/3/2545标准化操作中和剂加入

不同中和剂加入方式可能效果不一样。通过我们的经验，基本倾向于直接加入培养基中效果最好。但如果某些中和剂对微生物生长不利可考虑其他步骤加入。2023/3/2546标准化操作菌液加入按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑滤器的有效性。滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查〔如检查阳性菌液通过滤筒的流出液〕。2023/3/2547标准化操作菌液加入

而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。2023/3/2548实验器材药品无菌检查最关键的器材是一次性过滤器，价格和质量影响应用。近期主要考虑安全可靠、使用方便、物美价廉。远期应进一步考虑低残留、低吸附等。2023/3/2549实验器材关于实验器材问题，我们认为引入竞争、改进设计、推广应用，使产量、质量和用量稳步增长，成本和价格下降，使用户和企业双赢，有利于促进无菌检查方法更加规范和科学。2023/3/25502、微生物限度检查法验证实验要点样品菌种和实验用菌液〔同无菌检查〕回收率测定实验控制菌检查的验证实验器材2023/3/2551首先应是合格的样品。微生物限度检查样品2023/3/2552微生物限度检查样品样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证一般口服制剂验证大肠埃希菌外用制剂验证金葡和铜绿假单胞含药材原粉；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证2023/3/2553抽样量和检验量分别单列一项。抽样量一般抽样量为检验用量〔2个以上最小包装〕的3倍。检验量指供试品一次检验的用量。一般为10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品可酌减〔不得少于3g〕。检查沙门菌的供试品其检验量改为10g或10ml。验证实验按检验量执行。微生物限度检查样品2023/3/2554微生物限度检查样品制剂形式多样，决定前处理各异

难溶固体制剂非水溶性制剂软膏、油膏栓剂等2023/3/2555供试液的制备制备供试液所用的乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。7类供试品供试液的制备，其中增订：微生物限度检查样品前处理2023/3/2556非水溶性供试品

①司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80②供试品10g，20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠，必要时再加适量十四烷酸异丙酯，充分振摇，使供试品溶解。然后加45℃100蛋白胨氯化钠缓冲液，振摇5-10分钟，萃取，待油水分层后，取水层作为1：10供试液。微生物限度检查样品前处理2023/3/2557非水溶性膜剂供试品二部未变动，化学药膜剂取100cm2，剪碎，加100氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液。一部中药膜剂取50cm2，剪碎，加适量的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液〔50或100ml〕浸泡，振摇，以供试品浸液为供试液。〔SOP2000版规定:中药膜剂取30-50cm2，剪碎，加水100ml〕。微生物限度检查样品前处理2023/3/2558肠溶及结肠溶制剂供试品10g，加100无菌磷酸盐缓冲液〔肠溶制剂〕或无菌磷酸盐缓冲液〔结肠制剂〕,于45℃水浴振摇，使溶解。微生物限度检查样品前处理2023/3/2559气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冷冻室冷冻1h，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥钻一小孔，放置室温，并轻轻转动容器，使抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量加稀释剂至足量〔假设含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-80液〕，使匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10的供试液。微生物限度检查样品前处理2023/3/2560具抑菌活性的供试品供试品接种至较大量的培养基中。1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查，可加大增菌培养基的用量，或采用薄膜过滤法。离心集菌法薄膜过滤法

微生物限度检查样品前处理2023/3/2561微生物限度检查样品前处理很有用处的低速离心法〔500r/minX5min〕阿奇霉素缓释干混悬剂红霉素片2023/3/2562微生物限度检查样品前处理制剂形式多样，决定前处理各异目标是使不便于取样的供试品分散均匀！2023/3/2563微生物限度检查法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证

定量——回收率测定实验控制菌检查方法验证定性——能否生长、专属性实验2023/3/2564在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。

回收率测定实验2023/3/2565验证用菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉。菌液制备〔同无菌检查法〕。取培养物用无菌氯化钠溶液稀释成1ml含50～100cfu的菌液。回收率测定实验2023/3/2566验证方法试验组取规定量最低稀释级的供试液，加入50～100cfu的菌液，按平板菌落计数方法测定其菌数或薄膜过滤计数。菌液组测定加入的试验菌液的菌数。供试品对照组测定供试品稀释液〔本底〕的菌数。稀释剂对照组取稀释液加入50～100cfu的菌液，按供试品组供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。回收率测定实验2023/3/2567回收率计算

试验组的菌回收率=[〔试验组平均菌落数–供试品对照组平均菌落数〕/菌液组平均菌落数]×100%稀释剂对照组的菌回收率=[〔稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数〕]×100%

回收率测定实验2023/3/2568结果判断稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。假设试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌及酵母菌数；假设任一次平行试验中供试品组的菌回收率均小于70%，不符合验证试验，应建立新的检验方法，并重新验证。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。回收率测定实验2023/3/2569回收率测定实验常规法〔平皿法〕薄膜过滤法2023/3/2570回收率测定实验常规法〔平皿法〕在采用培养基稀释法时，应注意避免在注皿前菌液和供试液直接接触；2023/3/2571回收率测定实验常规法〔平皿法〕ml/ml/皿〕每一平皿均应加1ml菌液。培养基稀释的表示：1:200；1:400；1:10002023/3/2572回收率测定实验薄膜过滤法菌液检验〔计数〕应与供试液同法处理，也要采用薄膜过滤法。2023/3/2573

在建立供试品的控制菌检查法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。控制菌检查方法验证2023/3/2574验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。菌液制备〔同前〕：用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml含10-100cfu。控制菌检查方法验证2023/3/2575验证方法①试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接入增菌培养基中。②阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验