层析优秀公开课课件

第八章层析8.1概述8.2层析的基本原理与基本概念8.3层析分离方法介绍凝胶过滤，离子交换，疏水，羟基磷灰石，共价，反相及亲和层析等。层析是根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法又称色谱法，层离法，层析法;可用于生产规模，也可作为分析检测，控制产品的质量。㈠层析的概念8.1概述1903年，俄国植物学家Tswett提出色层分离法的概念1931年，Kuhn和Lederr在氧化铝和碳酸钙柱体上，以制备规模分离胡罗卜素和叶黄素。1938年，适用范围扩展到无色物质。1940～1943年间，Tswett提出了前流分析和置换分析法。50年代，气相色谱Martin和Synge，60年代，液相色谱DNA重组技术的发展，制备色谱研究成为热点㈡层析的发展历程8.1概述分离效率高：每米柱可达几千至几十万的塔板数，适于极复杂混合物的分离。应用范围广选择性强：通过操作方法，洗脱方式和操作条件来实现。高灵敏度的在线检测：紫外、荧光、折光等快速分离：高效层析剂和高压液相色谱过程的自动化操作㈢层析的特点8.1概述色谱分离的规模：色谱分析：<10mg半制备：10～50mg制备：0.1～10g工业生产：>20g/d㈣生物工业中的色谱分离8.1概述分析色谱与制备及工业色谱的比较：应用色谱技术范围不同：分析（柱，纸和薄板）；制备（柱）操作上不同：分析（进样量越小越好，检测灵敏度越高越佳；制备（进样量越大越好，色谱柱适当大）色谱分离理论不同：理论塔板数的不同；分配系数不同；样品保留值与峰高的不同㈣

生物工业中的色谱分离层析分类

流动相与固定相固定相的形状压力流动相的流动方向分离操作方式分配机理

2.固定相的形状根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸层析法、薄层层析法和柱层析法纸层析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于大量制备分离，是主要的层析分离手段。

层析分类

3.压力在以固体为固定相的液相柱层析中，根据操作压力的不同，分为低压(压力一般小于0.5MPa)、中压(压力为0.5～4.OMPa)和高压(压力为4.0～40MPa)液相层析法；高压液相层析法中层析介质(固定相)微细，分离精度高、速度快，主要用于成分分析。大量制备分离常用低压或中压液相层析法。层析分类

4.流动相的流动方向轴向流层析；径向流层析：溶质在半径方向上得到分离，优点是规模放大时，半径不变，通过增加柱高提高处理能力，且压降不会增加，适于大规模；但造价高。层析分类

层析分类

5.分离操作方式：洗脱展开降样品尽量浓缩，引入色谱柱上部，用溶剂洗脱（溶剂与固定相无亲和力），依亲和力的大小而速度不同，前进靠溶剂的推动。层析分类

5.分离操作方式：洗脱展开恒定洗脱法：不改变洗脱剂组成，优点是操作简单，不需要较复杂的设备；但洗脱剂组成需实验确定，太弱的洗脱剂不能有效洗脱，太强的洗脱剂，分辨率较差。逐次洗脱法：洗脱剂组成至少改变一次，优点是操作简单，重现性好，但洗脱条件一次改变后，有些组分会共同洗下，影响分离效果。梯度洗脱：逐次改变洗脱剂的组成，优点是消除重叠峰现象，但洗脱体积过大，组分浓度变稀。5.分离操作方式：迎头分析又称前流，前沿分析法，将待分离的混合物不断输入柱中，让它一直流下去，直到过程结束。亲和力小的先流出，一般不能达到组分的分离，只有作用力最弱的组分为纯品。适于除痕量杂质，组分浓度不会被稀释。层析分类

CABA+B6.分配机理凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析；疏水性相互作用层析和亲和层析等。层析分类

基本概念

1.分配系数：kd＝q/c2.阻滞因数Rf：溶质的迁移速率与一理想标准物质（既不吸附也不溶解）的移动速率之比，移动长度一样时：tm，

ts：理想物质和溶质的消耗时间tR：保留时间基本概念

2.阻滞因数Rf：基本概念

4.容量因子k：是固定相和流动相溶质数量之比容量因子是吸附剂对溶质亲和力的量度，k越低，从柱中流出的越早基本概念

5.选择性α：α＝kd1/kd26.分离度（分辨率）Rs：表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。为提高溶质之间的分离度，可以采用增大峰间距离或降低峰宽的方法。原理与操作

凝胶过滤介质

影响分离特性的因素

应用

特点

8.3层析方法介绍㈠凝胶过滤层析凝胶层析（gelchromatography）又称为凝胶排阻层析（gelexclusionchromatography）、分子筛层析（molecularsievechromatography）、凝胶过滤（gelfiltration）、凝胶渗透层析（gelpermeationchromatography）等。

8.3层析方法介绍㈠凝胶过滤层析原理与操作凝胶过滤层析(GFC)利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法；

GFC操作中溶质的分配系数m只是溶质相对分子质量、分子形状和凝胶结构(孔径分布)的函数，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关。原理与操作限定条件下，Vt，V0一定，Ve随分离物质分子量变化而变化，分子量增加，分配系数降低。两种溶质，kav差异大，分离效果好。凝胶过滤介质凝胶过滤介质应满足以下要求：亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；

具有一定的孔径分布范围；

机械强度高，允许较高的操作压力(流速)。凝胶过滤介质常用的凝胶过滤介质

凝胶过滤介质凝胶特性参数排阻极限(exclusionlimit)分级范围(fractionationrange)溶胀率：每g干凝胶吸收水分的百分数凝胶粒径床体积：1g干凝胶溶胀后占的体积空隙体积：凝胶之间空隙所占的体积，用2000kD的蓝色葡聚糖测定。凝胶过滤操作凝胶用量计算和处理：床体积/膨胀度；5～10倍蒸馏水浸泡悬浮除小颗粒0.5MNaOH~0.5MNaCl室温浸泡0.5h洗至中性层析柱选择：1：25～1：100，夹套控温装柱，凝胶柱鉴定（蓝，红葡聚糖）上样：（少，分辨率高），洗脱：（单一缓冲液），再生：(水反复逆相冲洗，缓冲液平衡）保存：洗净，适量防酶剂，酒精，冰箱。影响分离特性的因素线速度料液体积料液浓度：过高，洗脱曲线不规则，粘度分子量与分配系数的关系凝胶粒径线速度影响分离特性的因素影响分离特性的因素料液体积影响分离特性的因素分子量与分配系数的关系：选择分级范围小的介质，利于提高分离度应用分离纯化脱盐相对分子质量的测定

凝胶过滤特点GFC的优点如下：溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100％；每批分离操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；质活性收率高；分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。

GFC的不足之处在于：仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小；经GFC洗脱展开后产品被稀释，因此需要在具有浓缩作用的单元操作(如超滤、离子交换和亲和层析等)后使用。

凝胶过滤特点原理与操作IEC的应用特点㈡

离子交换层析8.3层析方法介绍原理与操作离子交换层析(Ionexchangechromatography，IEC)利用离子交换剂为固定相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法；阴离子交换基有DEAE，QAE；阳离子交换基为CM，P和SP。常用于制备离子交换剂的介质有Sephadex、Sepharose、TSKgelPW、Bio—Gel和纤维素等。㈡

离子交换层析洗脱时采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(lineargradiente1ution)或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(stepwiseelution)。小型层析柱的实验数据一般不能直接用于规模放大，而必须实施必要的探索性实验。

㈡

离子交换层析荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示：其中I为流动相的离子强度，A和B为常数，m∞为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。对于不同的溶质，式中的常数A和B不同，即在离子交换剂上的分配行为不同，因此在洗脱过程中彼此之间得到分离。㈡

离子交换层析线性梯度洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于洗脱的溶质在较小的流动相体积下洗脱。显然，通过改变流动相离子强度的增大速度(即浓度梯度)，可调整溶质的洗脱体积，即溶质洗脱峰之间的距离，在改善分离度的同时缩短洗脱时间。㈡

离子交换层析

逐次洗脱过程中，流动相的离子强度阶跃增大，因此溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是阶段式的。如果流动相离子强度的阶跃速度很快，逐次洗脱就接近了线性梯度洗脱；反之则接近恒定洗脱。因此逐次洗脱是介于恒定洗脱与线性梯度洗脱之间的一种洗脱法。

㈡

离子交换层析在线性梯度洗脱和逐次洗脱过程，IEC柱内溶质区带后部的离子强度高于前部，因此区带后部的移动速度高于前部，溶质在洗脱过程中得到浓缩。层析操作多采用线性梯度洗脱法或逐次沉脱法，只是流动相组成的变化情况各不相同。

㈡

离子交换层析IEC的应用IEC是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段。这主要是由于IEC基于离子交换的原理分离纯化生物产物，不仅具有通用性，而且选择性远高于GFC。

㈡

离子交换层析特点料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作；应用范围广泛，通过优化操作条件可大幅提高分离的选择性，所需柱长较短；产品回收率高；商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲和吸附剂。㈡

离子交换层析原理疏水性吸附剂操作特点㈢疏水层析8.3层析方法介绍原理硫水性相互作用层析(HIC)利用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，是根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法蛋白质的吸附(进料)需在高浓度盐溶液中进行，洗脱则主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。㈢疏水层析疏水性吸附剂疏水性吸附作用与配基的硫水性(疏水链长度)和配基密度成正比；配基修饰密度应根据配基的疏水性而异；疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶联主要利用介于氨苯的结合或醚键结合，形成各种疏水性吸附剂。㈢疏水层析常用商品化疏水吸附剂常用疏水吸附剂结构HIC操作

影响疏水性吸附的因素离子强度及种类破坏水化作用的物质表面活性剂温度㈢疏水层析蛋白质的分离

HIC不仅是一种有效的分离纯化手段，而且还可与IEC互补短长，分离纯化利用IEC难于分离的蛋白质。在利用HIC分离蛋白质的混合物时，需事先利用各种小型预装柱进行吸附与洗脱实验，确定最佳吸附剂和洗脱分离溶剂。

㈢疏水层析HIC的特点由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液；可通过调节疏水配基链长和密度调节吸附力，并根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂；疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。㈢疏水层析反相层析(Reversed-phasechromatography，RPC)利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法；用于相对分子质量低于5000，特别是l000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。

㈣反相层析8.3层析方法介绍溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大；当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数、流动相的极性越大，溶质的分配系数越大；可采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。

㈣反相层析反相介质中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键合非极性分子层制备。

㈣反相层析超临界流体层析(Supercriticalfluidchromatography，SFC)是利用超临界流体为流动相的洗脱层析法；利用超临界流体作为流动相参与溶质在固定相上的分配，可提高溶质在固定相中的扩散速率，提高分离速度和柱效；SFC常采用增大压力的压力梯度洗脱法，也可采用改变溶剂浓度（极性）的浓度梯度洗脱法。

㈤超临界流体层析

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是一种磷酸钙晶体，吸附主要基于钙离子和磷酸根离子的静电引力；

HAP层析通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线性梯度脱法；用于识别DNA及RNA的单链和双链，分离IEC和HIC难于分离的蛋白质等物系；

HAP吸附剂价格便宜，远低于离子交换剂，适用于大规模分离纯化过程，已成为单克隆抗体的主要纯化手段。㈥羟基磷灰石层析原理与操作

亲和吸附介质亲和层析过程

应用㈦亲和层析亲和作用体系

特异性亲和体系高特异性

群特异性抗原-单克隆抗体荷尔蒙-受体蛋白核酸-互补碱基链段、核酸结合蛋白酶—底物、产物、抑制剂免疫球蛋白—A蛋白、G蛋白酶—辅酶凝集素—糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质—肝素酶、蛋白质—活性色素(染料)酶、蛋白质—过渡金属离子(Cu2+，Zn2+等)酶、蛋白质—氨基酸(组氨酸等)

亲和作用体系将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子（通称为目标产物）容易从混合物中得到选择性分离纯化;在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合对象(一般为蛋白质)的配基(ligand)。

用L表示配基，E表示蛋白质，可逆性亲和结合作用可表示为

：其中，E·L为蛋白质与配基形成的复合体。上述结合反应的解离常数为：结合常数为：

原理与操作亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法；由于目标产物基于生物亲和作用吸附在固定相上，具有高度的选择性，因此，亲和层析操作与一般的固定床吸附操作方式相同，多采用断通式前端分析法。

亲和吸附介质亲和配基亲和吸附介质间隔臂

亲和配基酶的抑制剂抗体：免疫亲和层析A蛋白（proteinA）

凝集素（lectin）亲和配基辅酶和磷酸腺苷三嗪类色素（triazinedyes）:色素亲和层析（Dye－ligandaffinitychromatography）过渡金属离子：金属螯合层析

(Metalchelatechromatography)组氨酸肝素(heparin)亲和吸附介质

亲和吸附介质又称亲和载体。作为载体的固体粒子应该满足以下要求：具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；粒径均一的球形粒子。

亲和吸附介质

利用凝胶过滤介质合成所需的亲和吸附介质的合成方法：溴化腈活化法：用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的配基(R—NH2)；环氧基活化法：用于多糖凝胶和表面为