RTPCR原理和实验步骤

RT—PCR原理与实验步骤知识背景:1、基因表达:DNARNAProteinmRNA(每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白)共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因得mRNA表达水平对于其功能水平得调控就是非常重要得。2、PCR技术(Polymerasechainreaction):即聚合酶链式反应、在模板、引物与四种脱氧核苷酸存在得条件下依赖于DNA聚合酶得酶促反应,其异性由两个人工合成得引物序列决定、反应分三步:A.变性:通过加热使DNA双螺旋得氢键断裂,形成单链DNA;C、延伸:在DNA聚合酶与dNTPs及Mg2＋存在下,退火引物沿5’3’方向延伸。伸复。3、逆转录酶与RT—PCR逆转录酶(reversetranscriptase)就是存在于RNA病毒体内得依赖RNA得DNA聚合酶,至少具有以下三种活性:1、依赖RNA得DNA聚合酶活性:以RNA为模板合成cDNA第一条链;Rnase水解活性:水解RNA:DNA杂合体中得RNA;3、依赖DNA得DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补得双链cDNA、1)引物得特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计就是否合理对于整个实验有着影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在得同源序列,同种蛋白得不同亚型,不同得mRNA剪切方式以及可能存在得hnRNA对引物得特异性得影响、尽量选择个内含子得引物,或者在目得蛋白表达过程中特异存在而在其她亚型中不存得内含子。2)引物设计原则得把握引物设计原则包括:a、引物长度:一般为15~30bp,引物太短会影响PCR得特异性,引物太长PCR得最适延伸温度会超过Taq酶得最适温度,也影响反应得特异性、b嘌呤或嘧啶得聚集存在,特别就是连续出现3个以上得单一碱基。GC含量(Tm值):40％~60%,PCR扩增得复性温度一般就是较低Tm值减去5~10度。构得可能。末位碱基就是A时错配得引发效率最低,G、C居中间,因此引物得3’端最d构:引物自身不应存在互补序列,否则会自身折叠成发夹状结构或引CR稳定。还可以进行特异修饰(标记、酶切位点等)等等、根据实验目得选择适当得引物。常用引物设计软件如Primer5。0,Oligo6。C水浸泡处理,除去RNA酶,防止操作过程中RNA降解、然后经高压灭活(灭菌与灭活DEPC)。分离得最关键因素就是尽量减少RNA酶得污染。但RNA酶活性非常稳定,分布广泛,除RNA酶外,环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时,应尽量创造一个无RNA酶得环境,包括去除外源性RNA酶污染与抑制内源性RNA酶活性,主要就是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶,通过RNA酶得阻抑蛋白Rnasin与强力得蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶、RRNA得琼脂糖凝胶电泳实验原理与步骤条件下A得泳动率才与分子量得对数呈线性关系。因此要测定R分子量三、实验材料、器具及药品测仪等、琼脂糖E电泳缓冲液0.5μg/ml溴化乙锭载样缓冲1用TE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶加电泳缓冲液至液面覆盖凝打开电源开关调节电压至10使NA由负极向正极电泳约i后将凝胶放入E染液中染色用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA得变性琼脂糖凝胶检测1MOS缓冲液＊、l不啉代丙烷磺酸S(7、1moN1moLD。2上样染料0％甘油o／D、％溴酚蓝％二甲苯蓝。乙醇干燥——H2O灌满——室温放置10分钟—。％C水冲1将制胶用具用7乙醇冲冼一遍晾干备用。①称取g琼脂糖置干净得m锥形瓶中加入m蒸馏水微波炉内加②待胶凉至6—℃依次向其中加入9甲醛、5mXP缓冲①取处理过得小离心管依次加入如下试剂xO缓冲液l甲醛。甲酰胺去离子10N