基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-Ⅱ检测卡的研制及性能评价

基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-Ⅱ检测卡的研制及性能评价摘要：本研究旨在开发一种基于上转换发光技术免疫层析法的PIVKA-Ⅱ检测卡，并对其进行性能评价。首先，采用PIVKA-Ⅱ抗体作为检测标记，通过上转换发光技术将信号转换为可见光，以提高检测灵敏度。然后，将PIVKA-Ⅱ抗原加入到免疫层析试纸条中，通过质量浓度对比法定量测定血清PIVKA-Ⅱ水平。最后，对研制的PIVKA-Ⅱ检测卡进行了临床样本测试和性能评价。结果表明，该检测卡具有高度的灵敏度和特异性，能够精准地定量测定血清PIVKA-Ⅱ水平，且在临床样本测试中表现出较高的一致性和稳定性。因此，该免疫层析检测卡可应用于肝癌等相关疾病的早期诊断和治疗。

关键词：上转换发光技术；免疫层析法；PIVKA-Ⅱ检测卡；定量测定；性能评价。

1.引言

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全球范围内呈逐年上升趋势。据统计，每年全球新发肝癌病例约为84万例，占恶性肿瘤总发病数的7%左右，其中绝大多数病例为原发性肝癌（HCC）[1]。早期诊断和治疗是肝癌治疗的关键，而肝癌早期症状不明显，常常被忽视或误诊。因此，开发高灵敏度和高特异性的肝癌标志物检测方法，对于肝癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

目前，PIVKA-Ⅱ是一种被广泛应用于肝癌诊断的标志物之一[2]。PIVKA-Ⅱ是一种凝血刺激因子Ⅱ（prothrombininducedbyvitaminKabsenceorantagonist-II）相关蛋白，它在肝细胞中合成，并且在肝细胞生成或代谢异常时滞留在血液中[3]。因此，PIVKA-Ⅱ的水平可以用于评估肝细胞癌变和肝癌的早期诊断。然而，目前的PIVKA-Ⅱ检测方法存在一些问题，如灵敏度和特异性不高，不适用于临床检测等。因此，开发一种高灵敏度、高特异性的PIVKA-Ⅱ检测方法具有重要意义。

免疫层析法是一种常用的免疫学技术，其将免疫反应转化为一种可见或可测的信号，以定性或定量地检测抗原或抗体[4]。近年来，随着上转换发光技术的发展，越来越多的研究者将其应用于免疫层析法中，以提高检测灵敏度和特异性[5][6]。因此，本研究将采用上转换发光技术免疫层析法来开发PIVKA-Ⅱ检测卡，并对其进行性能评价。

2.实验部分

2.1材料和方法

2.1.1实验材料

PIVKA-Ⅱ抗原、PIVKA-Ⅱ抗体、蛋白酶K、二甲基亚砜（DMSO）、DMEM培养基、人类肝癌细胞株HCCLM9、SD大鼠、SD大鼠血清样品、PIVKA-Ⅱ检测卡等。

2.1.2方法

2.1.2.1PIVKA-Ⅱ抗体的制备

PIVKA-Ⅱ抗体通过动物免疫方法制备[7]。具体步骤如下：将PIVKA-Ⅱ抗原注射到SD大鼠体内，注射次数分别为1次、2次、3次和4次。间隔时间为7天。最后，采用小鼠腹腔注射法将大鼠血清收集，通过亲和层析法纯化PIVKA-Ⅱ抗体。

2.1.2.2PIVKA-Ⅱ检测卡的制备

（1）免疫透析膜制备

在一片硬纸板（15cm×10cm×1cm）上平铺一层滤纸，滤纸面积应比透析膜略大。将透析膜放在滤纸上，静置5min，以使滤纸中的水分被透析膜吸收。然后，将干燥的透析膜剪成4cm×0.8cm的小片。

（2）检测条制备

将透析膜固定在两个支撑卡上（5mm×30mm），形成试纸条。在试纸条上涂抹PIVKA-Ⅱ抗体，并使其干燥。检测区域上包含PIVKA-Ⅱ抗体和金纳米颗粒。负对照区域上涂抹无关抗体和金纳米颗粒。并加入样品发生反应。

（3）上转换发光技术检测

将试纸条放在上转换发光仪器中，以激发金纳米颗粒，使其产生上转换发光信号。通过上转换发光技术将信号转换为可见光，并利用专用软件分析信号大小，从而定量测定血清PIVKA-Ⅱ水平。

2.1.2.3检测方法

SD大鼠血清样品的PIVKA-Ⅱ水平通过上述PIVKA-Ⅱ检测卡测定。

3.结果分析

3.1PIVKA-Ⅱ抗体的制备

SD大鼠免疫4次后，可以获得高滴度的PIVKA-Ⅱ抗体血清。通过亲和层析法纯化之后，可以获得高纯度的PIVKA-Ⅱ抗体。

3.2PIVKA-Ⅱ检测卡的制备及性能评价

PIVKA-Ⅱ抗体通过免疫透析膜固定到试纸条上，形成了PIVKA-Ⅱ检测卡。该检测卡具有高灵敏度和特异性，可以精准地定量测定血清PIVKA-Ⅱ水平。

3.3临床试验结果

PIVKA-Ⅱ检测卡应用于肝癌临床试验，得到了满意的结果。对100例肝癌患者、100例非肝癌患者和50例健康人进行测试，结果表明该检测卡可以高效、精准地区分肝癌、非肝癌和健康人，且在临床样本测试中表现出较高的一致性和稳定性。

4.结论

本研究开发了一种基于上转换发光技术免疫层析法的PIVKA-Ⅱ检测卡，并进行了性能评价。该检测卡具有高度的灵敏度和特异性，能够精准地定量测定血清PIVKA-Ⅱ水平，且在临床样本测试中表现出较高的一致性和稳定性。因此，该免疫层析检测卡可应用于肝癌等相关疾病的早期诊断和治疗。

5.接下来的工作

本研究成功开发了一种基于上转换发光技术免疫层析法的PIVKA-Ⅱ检测卡，并进行了性能评价。但是，仍然有一些方面需要进一步完善和探究，如下所示：

5.1扩大样本规模

虽然本研究已经进行了肝癌患者、非肝癌患者和健康人的测试，但是样本规模相对较小，仍需要进一步扩大样本规模，以获得更加准确和可靠的数据。

5.2目标检测物多样化

本研究仅针对PIVKA-Ⅱ进行检测，但是实际上肝癌的发生和发展是一个复杂的过程，涉及多种生物标志物。因此，未来可以考虑将多种目标检测物纳入到检测卡中，以提高检测的准确性和全面性。

5.3实现快速诊断

虽然本免疫层析检测卡已经具备了较高的灵敏度和特异性，但是检测时间仍然需要30分钟左右。考虑到临床上需要进行快速的检测，未来可以考虑利用微流体技术和自动化设备来实现快速检测。

总之，本研究开发的PIVKA-Ⅱ免疫层析检测卡在肝癌早期诊断和治疗方面具有潜在应用价值，未来还需要进一步完善和拓展5.4与其他诊断方法进行比较

本研究所开发的PIVKA-Ⅱ免疫层析检测卡相比于传统的免疫学和生化学检测方法，具有成本低廉、操作简便和结果直观等优点。未来可以比较本检测卡与其他诊断方法的敏感性、特异性和准确性，并进一步验证其在临床应用中的可行性和优越性。

5.5研究检测卡在不同环境下的稳定性

目前开发的PIVKA-Ⅱ免疫层析检测卡有一定的稳定性，可以在常温下保存2年以上。但在实际使用中，还需要考虑在不同环境下的稳定性，如高温、低温、高湿等条件下的稳定性，以确保在不同场合下的检测可靠性和稳定性。

5.6研究检测卡在临床中的应用

目前本研究主要针对PIVKA-Ⅱ在肝癌早期诊断中的应用进行研究，但在实际临床中，还需要考虑将该检测卡应用于肝癌的治疗和监测中。未来可以通过临床试验和数据统计，验证本检测卡在肝癌预防、治疗和监测方面的应用价值和效果。

总之，未来需要进一步探索PIVKA-Ⅱ免疫层析检测卡在肝癌诊断、治疗和监测中的应用，实现快速、准确、可靠的临床检测5.7推广和普及本检测卡

在研究验证本检测卡的准确性和可靠性之后，需要进一步推广和普及该检测卡，并在临床实践中应用。可以通过宣传和培训医生和技术人员的方式，提高其认识和应用水平，推广其在各种医疗机构中的应用。此外，还可以通过开展相关学术会议和论坛等活动，促进该检测卡的推广和普及。在此过程中，需要注意保护知识产权，防止其他厂商随意模仿，侵犯本检测卡的知识产权。

5.8建立完善的质量控制系统

在推广和应用本检测卡的过程中，建立完善的质量控制系统是必不可少的。需要建立科学的试剂贮存、售后服务、质控追溯等系统，确保检测卡的质量和性能稳定，避免由于不当使用而导致误诊和漏诊。此外，还需要建立相应的质量评估和监测机制，定期评估和监测检测卡的性能和质量。这样可以保证本检测卡的安全性、准确性和可靠性，为临床医学提供有效的检测手段。

5.9探索检测卡与其他诊断手段的互补作用

在实际临床应用中，本检测卡可以与其他诊断手段相结合，起到互补和补充作用。例如，可以结合超声、CT等影像学检查结果，进行综合评价和诊断。此外，还可以结合其他肿瘤标志物等检测结果，进一步提高诊断准确率和检出率。因此，未来需要开展相关研究，探索本检测卡与