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文档简介
H4受体介导组胺刺激 AtT作者:孟嘉,谢建军,杨铁虹,王海芳,李明凯,胡静 ,罗晓星【关键词】组胺【Abstract】AIM:Toclarifythesubtypeofhistamine(HA)receptorwhichmediatesAdrenocorticotropicHormone(ACTH)releasefrommouseanteriorpituitarytumorcelllineAtT20.METHODS:ELISAassaywasusedtodeterminetheeffectsofavarietyofhistaminereceptorsubtypespecificagonistsandantagonistsonACTHreleasefromAtT20cells.TheexpressionofH4receptormRNAonAtT20cellswasdetectedbyRTPCRandthePCRproductwassequenced.RESULTS:①HA(108mol/L)significantlyacceleratedthereleaseofACTH(pmol/L)fromAtT20cells(±vs±incontrol,P<).ThehistamineH1receptorspecificantagonistChlorpheniramine(±)andhistamineH2receptorspecificantagonistRanitidine(±)didnotinhibittheeffectofHA.②ThesameasHA,histamineH3andH4receptoragonistR(α)Methylhistamine(10-7mol/L)increasedthereleaseofACTHfromAtT20cells(±).③H4receptorspecificantagonistJNJ777120(1[(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl]4methylpiperazine)demonstratedaconcentrationdependentinhibitoryeffectontheincreasingACTHsecretioninducedbyHA,andtheeffectofHAwastotallyabolishedbyJNJ777120at10-5mol/L.④RTPCRconfirmedthatAtT20cellspresentedanendogenousexpressionofH4receptormRNA.CONCLUSION:HAstimulatesthereleaseofACTHfromAtT20cellsthroughH4receptormediation.Keywords】histamine;receptors,histamineH4;AtT20cell;corticotropin【摘要】 目的:阐明介导小鼠垂体前叶瘤细胞株 (AtT20)分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)的组胺(HA)受体亚型. 方法:体外培养AtT20细胞,ELISA检测各
HA受体亚型的激动剂和拮抗剂对
AtT20细胞分泌
ACTH的影响;利用RTPCR方法检测AtT20细胞中H4受体mRNA的表达.结果:①HA(10-8mol/L)作用于AtT20细胞6h,ACTH分泌量(pmol/L)增加(±),与对照组相比(±)有显著差异(P<);而组胺H1受体特异性拮抗剂扑尔敏(±)和H2受体特异性拮抗剂雷尼替丁(±)不能拮抗此效应.②HAH3和H4受体激动剂R(α)甲基组胺(10-7mol/L)同HA作用相似,能够促进 AtT20细胞分泌ACTH(±).③HAH4受体的特异拮抗剂
JNJ777120(1[(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl
]4methylpiperazine)
能够剂量依赖性拮抗
HA促进
AtT20细胞释放
ACTH的效应,当浓度为10-5mol/L 时,HA的效应被完全阻断细胞中存在组胺 H4受体mRNA的内源性表达.
.
④RTPCR结果证实,在AtT20结论:HA调控AtT20细胞分泌ACTH的作用由H4受体介导.【关键词】 组胺;受体,组胺
H4;AtT20
细胞;促肾上腺皮质激素0引言组胺(histamine, HA)是生物体内具有功能活性的一种重要物质, 通过不同的HA受体调节多种生理功能.HA能够调节垂体分泌促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH),该效应被认为是由 H3受体介导的[1].但是近年来的研究发现[ 2],这一结论还存在一些无法解释的疑点 .20XX年H4受体首次被发现[3],随着对其研究的深入[4],许多研究结果提示 HA调节ACTH释放的效应极有可能是由 H4受体介导的,而并非H3受体. 本研究采用能够特异性分泌ACTH的小鼠垂体前叶瘤细胞系(AtT20)为模型,观察ACTH的释放是否由HAH4受体调节,以明确HA促进ACTH分泌的机制,为深入研究HA的免疫调节作用提供新的线索,并可为临床治疗异位ACTH综合征提供新的思路.材料和方法材料AtT20细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所(从美国 ATCC引进,编号:CRL1795);DMEM高糖培养液购自美国Gbico公司;新生牛血清购自杭州四季青生物材料研究所;L谷氨酸、组胺、雷尼替丁、扑尔敏及R(α)甲基组胺购自美国Sigma公司;ACTH检测试剂盒购自美国Market公司;JNJ777120(1[(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl]4methylpiperazine,JNJ)由美国强生公司RobinL.Thurmond博士馈赠;Trizol,反转录酶(SuperScriptⅢ)购自美国Invitrogen公司;Taq酶购自日本Takara公司;Balb/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供.方法细胞培养将AtT20细胞株,接种于含100mL/L新生牛血清,4mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培养液中,置于950mL/LO2,50mL/LCO2孵箱中培养,以后每2~3d以g/L胰酶消化后按1∶3传代.所使用的细胞均为处于指数增长期,且在传代20代以内的细胞.受体激动剂和拮抗剂对 AtT20细胞分泌ACTH的影响将AtT20细胞以2×105个/孔的密度接种于24孔板,24h后换用不含血清的培养液,并按实验分组设计加入不同浓度的各种HA受体激动剂及拮抗剂,6h后收集各孔上清液,离心去除脱落细胞,按照试剂盒操作步骤进行ELISA测定,根据标准曲线换算所含ACTH的浓度.实验共分A~I9组,分别为A:基础状态;B:组胺(10-8mol/L);C:HA(10-8mol/L)+扑尔敏(10-5mol/L);D:HA(10-8mol/L)+雷尼替丁(10-5mol/L);E:R(α)甲基组胺(10-7mol/L);F:HA(10-8mol/L)+JNJ(10-8mol/L);G:HA(10-8mol/L)+JNJ(10-7mol/L);H:HA(10-8mol/L)+JNJ(10-6mol/L);I:HA(10-8mol/L)+JNJ(10-5mol/L).每组各设一个复孔,每组试验重复6次.检测H4受体mRNA的表达用Trizol处理AtT20细胞和成年Balb/c小鼠的垂体,提取总RNA.小鼠中按H4受体在Genebank中的编号为gi:15420534,全长1538bp,扩增HAH4受体mRNA所用引物:上游引物5′ATGCGGAGTCTAACAGTACTGG3′,下游引物5′GAAGATACTGACTGGTTCT3′[8].使用随机引物反转录,反应参照试剂盒说明进行操作;PCR反应条件:94℃5min;94℃1min,53℃
30s
,72℃
1min
,35个循环;72℃延伸
5min.
反应结束后产物行
10g/L
琼脂糖凝胶电泳
,
以凝胶成像系统观察并记录电泳结果
,
回收并测序.统计学处理:
数据以
x±s表示,采用
SPSS统计软件进行单因素方差分析.P<认为差异有统计学意义.结果细胞培养对传代l~8d后的细胞进行观察,并用OLYPUS(IX71)倒置荧光生物显微镜拍照.细胞消化分散后呈小圆形,传代ld后单个细胞呈梭形或三角形,体积较小,细胞中央隐约可见细小圆形颗粒;2~4d后细胞体积逐渐增大,单个细胞呈梭状,岛状或枫叶状,有的呈多角形或簇状接合,部分体积较大的细胞开始融合,细胞中央颗粒明显可见(图1);5~6d,大部分细胞融合紧密,有的已呈层叠生长,并出现细胞脱落,同时在大片融合细胞的边缘可见新生出的梭状小细胞;至8d细胞脱落明显,个别区域呈大片脱落,原已融合成片的细胞层块中央呈空穴状.图1光学显微镜下AtT20细胞形态×400(略)受体激动剂和拮抗剂对 AtT20细胞分泌ACTH的影响给与HA(10-8刺激6h后AtT20细胞的ACTH分泌量(±)pmol/L 较基础状态(±)pmol/L增加(P<);而在给与HA的同时给与H1受体拮抗剂扑尔敏 (10-5 mol/L)
mol/L)显著或H2受体拮抗剂雷尼替丁(10-5 mol/L),ACTH分泌量分别为(±)pmol/L 和(±)pmol/L,与HA组相比无明显差异,即不能拮抗 HA的作用. 当给与H3受体和H4受体的激动剂R(α)甲基组胺(10-7mol/L),ACTH分泌量(±)pmol/L较基础状态显著增加(P<).HA促进ACTH释放的效应可为特异性 H4受体阻断剂JNJ所拮抗,且具有明显的剂量依赖性,当 JNJ浓度增至10-5mol/L时,ACTH的分泌量同基础状态相比无统计学差异, HA促进ACTH释放的效应被完全阻断(图 2).A:基础状态; B:HA(10-8mol/L) ; F:HA(10-8mol/L)JNJ(10-8mol/L) ;G:HA(10-8mol/L) +JNJ(10-7mol/L) ; H:
+HA(10-8mol/L) +JNJ(10-6mol/L) ;I:HA(10-8mol/L)mol/L). aP<vs基础状态;bP<vsHA(10-8mol/L).
+JNJ(10-5图2H4受体特异性拮抗剂 JNJ对HA刺激AtT20细胞释放ACTH的影响(略)受体mRNA的表达取AtT20细胞及正常Balb/c小鼠垂体RNA的RTPCR产物各5μL行10g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪成像,可见一大小为 1185bp特异性条带,而阴性对照孔(以总 RNA为模板直接PCR)的相应位置处未见条带(图3).将所得片段切胶回收送检测序.将测序结果与Genebank中的小鼠HAH4受体序列(gi:15420534)BLAST对比完全吻合,说明AtT20细胞中以及小鼠垂体中均有HAH4受体mRNA的表达.M:DL20XXmarker; 1, 2:H4受体在AtT20细胞及小鼠垂体表达的 RTPCR产物;3,4:H4
受体在
AtT20细胞及小鼠垂体表达的阴性对照图3AtT20
细胞中及小鼠垂体
HAH4受体
mRNA的表达(略)3讨论H4受体为20XX年新发现的HA受体亚型,其氨基酸序列与 H1,H2受体同源性较低,而与 H3受体的同源性较高,在跨膜区其同源性高达 58%,这使得它们在药理学特性上也存在交叉重叠现象 [3]. 包括RAMHA及thioperamide 在内的大多数H3受体的特异配体对 H4受体也有作用,只是亲和力不同[ 5]. 本实验结果显示,
H1和
H2受体特异拮抗剂扑尔敏及雷尼替丁无法拮抗
HA促进AtT20细胞分泌ACTH的效应;同时,HAH3,H4受体的激动剂RAMHA(10-7mol/L)可以模拟同等强度的HA(10-8mol/L)促进ACTH释放效应,这与H4受体的动力学特点相符;而HAH4受体的高选择性特异拮抗剂JNJ[6]能够特异性拮抗HA的作用,且有明确的剂量效应关系;此外,在 AtT20细胞中检测到内源性 H4受体mRNA的表达. 以上研究结果表明 HA调控AtT20细胞分泌ACTH的作用是由H4受体介导的.HAH4受体主要分布在外周组织,高表达于与炎症反应相关的组织和造血细胞中,故目前对 H4受体的研究多集中于免疫和造血以及干细胞分化等方面的功能[7-9].本研究表明H4受体介导HA刺激AtT20细胞分泌ACTH,同时亦在正常小鼠的垂体组织中检测到H4受体mRNA的表达.小鼠与人的H4受体同源性高达69%[4],提示HA刺激人垂体分泌ACTH的作用可能也由H4受体介导.ACTH在中枢神经系统具有神经损伤后的恢复与再生及学习记忆等多种生理功能. 脑内肿瘤或脑创伤时,常影响下丘脑功能,出现下丘脑垂体机能失调而使ACTH分泌相对不足.临床研究证明脑肿瘤、脑外伤时提高血中ACTH的浓度,可明显改善和恢复脑细胞的功能并缓解意识障碍、头痛、呕吐等症状.本研究证明了HAH4受体可以调控AtT20细胞分泌ACTH,为临床脑肿瘤及脑外伤的治疗及术前准备提供新的思路,为深入研究HA的免疫调节作用提供新的线索,并为临床治疗异位ACTH综合征提供新思路.【参考文献】[1]ClarkMA,KorteA,MyersJ,et al.HighaffinityhistamineH3receptors regulate ACTHrelease byAtT20cells [J].EurJPharmacol,1992,210:31-35.[2]谢建军,罗晓星,赵德化.组胺H3受体对垂体瘤AtT20细胞分泌ACTH的调节作用[J].第四军医大学学报,20XX,22:584-586.[3]OdaT,MorikawaN,SaitoY,etal.Molecularcloningandcharacterizationofnoveltypeofhistaminereceptorpreferentiallyexpressedinleukocytes[J].JBiolChem,20XX,275:36781-36786.[4]LiuC,WilsonSJ,KueiC,eta1.Comparisonofhuman,mouse,rat,andguineapighistamineH4receptorsrevealssubstantialpharmacologicalspeciesvariation[J].JPharmacolExpTher,20XX,299(1):121-130.[5]HoughLB.Genomicsmeetshistaminereceptor:newsubtypes,new
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