1.细胞工程-欧阳高亮

SchoolofLifeSciences,XiamenUniversityProf.GaoliangOuyang(欧阳高亮)Dr.ShuyongLin(林舒勇)生命科学导论细胞和细胞工程生命科学研究的范畴和层次核心领域：生物学（动物学，植物学等），生物医学（疾病相关研究）小分子-生物大分子-细胞器-细胞-组织-器官-生物个体-群落-生态系统Science2014年度十大科学进展Science,Dec.2014Thebirthofbirds——恐龙向鸟类进化Youthserumforreal?——年轻血液助推返老还童Chipsthatmimicthebrain——神经形态芯片Cellsthatmightcurediabetes——人工诱导的可用于治疗的β细胞Manipulatingmemory——操控记忆Givinglifeabiggergeneticalphabet——扩充遗传字母Featherswerewidespreadevenamongdinosaurs,suchasKulindadromeus,thatwerenotcloselyrelatedtobirds.AmericanAssociationfortheAdvancementofScienceScience2014;346:1444-1449UsingyoungbloodtofightoldageLinkinganoldmousetothecirculationofayoungmouseorinjectingtheanimalwithaproteincalledgrowthdifferentiationfactor11reversedsignsofaginginmuscleandthebrain.GDF11：growthdifferentiationfactor11CellsthatmightcurediabetesF.W.Pagliucaetal.,“GenerationofFunctionalHumanPancreaticβCellsInVitro,”Cell159,2(9October2014).Twoweeksaftertransplantintoadiabeticmouse,humanpancreaticβcellsmadeinthelabproduceenoughinsulin(green)tocuretheanimal.ManipulatingmemoryByzappingthebraincellsofmicewithlight,researcherscancreate,erase,oraltermemories.Usingbluelaserlight,scientistsmanipulatedneuralcircuitsconnectingthehippocampusandamygdala(regionsinred)totransformnegativememoriesintogoodones.Givinglifeabiggergeneticalphabet：Byaddinganewbasepair,XandY,toDNA'sA-TandG-Cpairs,researcherswillenableorganismstobuildproteinsfromasmanyas172differentaminoacidsChipsthatmimicthebrain“Neuromorphic”chipsinspiredbynetworksofbraincellsmayexcelatdata-intensivetaskssuchasvision.Science2013年度十大科学进展Science,Dec.2013体外培养器官——DishingupMini-Organs成功培养的“类器官”肝笌肾脏人类大脑2013年度十大科学进展睡眠“洗脑”——ToSleep,PerchancetoClean2013年度十大科学进展微生物和健康——YourMicrobes,YourHealthGutsense.Microbesmaybekeyplayersinmalnutritionandotheraspectsofhealth.三聚氰胺-肾结石(1%婴儿携带克雷伯氏菌）癌症肥胖症重度营养不良关节炎2013年度十大科学进展根据细胞的内部结构，可将生物界的细胞分为两大类：原核细胞（prokaryotes）和真核细胞（eukaryotes）细菌、蓝藻和放线菌等由原核细胞构成的有机体称为原核生物，几乎所有的原核生物都由单个原核细胞构成。由真核细胞构成的有机体则称为真核生物，真核细胞大多存在于多细胞生物中。单细胞生物与多细胞生物在适应环境等方面各有千秋.（一）细胞分类一.细胞的基础知识（二）细胞的大小和形态支原体（mycoplasma）巨型乌贼神经细胞（nervecell）蕨藻（caulerpa）无论各种细胞的大小和形态有多大的差异，它们都由一层具有一定生物学功能的细胞膜包裹在细胞外层。由于这层细胞膜将细胞内部和外部环境分隔开，使细胞内部的各种生命活动发生在特定的环境中保障了单细胞个体的生命活动和多细胞个体中不同功能细胞的相对独立性，使其成为生物体的功能单位。（三）细胞的结构结构简单，因而相对较小没有细胞核和大多数细胞器（恒定的内膜系统)细菌和古细菌两类三个结构区域：鞭毛或纤毛，胞外被膜和细胞质I.原核细胞Prokaryoticcells

三大结构体系：生物膜系统：质膜、内膜系统（细胞器）

遗传信息表达系统：染色质(体)、核糖体、mRNA、tRNA等

细胞骨架系统：胞质骨架、核骨架II.真核细胞（eukaryoticcells）chromatidG0期:休眠期G1期:DNA合成前期S期:DNA合成期G2期:

DNA合成后期M期:有丝分裂期（一）细胞增殖二.细胞的功能～20h细胞分裂三种方式

(二)细胞分化多细胞生物体是由各种各样形态和功能都不同的细胞群所组成。高等动、植物由受精卵细胞开始的胚胎发生过程随着细胞分裂次数的增加而使得早期胚胎的细胞数量也增加许多。其中有些细胞在形态、结构和功能上逐渐发生了差异，这种细胞之间差异的发生过程就是细胞分化。个体发育的过程就是细胞分化的过程，个体的各种器官和组织都是通过细胞分化形成的。

囊胚原肠胚细胞增殖——数量细胞分化——功能细胞的衰老和死亡

(三)细胞衰老和死亡

June,1919NationalGeographicMagazine生物个体水平的衰老Organismalsenescence细胞的衰老Cellularsenescence衰老Senescence(“togrowold”)随着时间流逝，分子和细胞结构的改变导致代谢功能退化和死亡的过程。Division20times50timesHayflick'sLimit(Hayflickphenomenon)1961人二倍体成纤维细胞体外连续培养时，增殖能力有一定限度(大约分裂50次)。生长停滞，失去有丝分裂的能力，在细胞内积累大量碎片和颗粒，最终死亡。20世纪早期的主流观点：

细胞能无限生长（AlexisCarrel）与供体年龄相关胎儿50次成人20次与供体物种相关小鼠14-28次乌龟90-125次体外培养成纤维细胞衰老细胞的罪行促进肿瘤生长和散播导致周边组织损伤加剧衰老相关的炎症反应细胞衰老意义防止不断累积的遗传物质的损伤带来的恶果27细胞凋亡(apoptosis,“tofall”)为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的自杀性行为，也称为I型程序性细胞死亡。树叶凋落一个成人体内，每天500-700亿个细胞通过细胞凋亡死去细胞凋亡是个体正常发育所需蝌蚪尾巴的消失胚胎的手指和脚趾形成免疫系统的成熟大脑中神经元的正确连接细胞凋亡是摧毁受损细胞所需DNA损伤的细胞肿瘤细胞被病毒感染的细胞为什么需要启动自杀性的凋亡程序？MolecularBiologyoftheCell亮绿色荧光染料指示凋亡细胞一天之后MolecularBiologyoftheCell胚胎的手指和脚趾形成神经退行性疾病特定神经元进行性丧失为病理特征的疾病阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD,老年痴呆)帕金森氏症(Parkinson’sdisease)AD主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经元大量丧失引起的，病理切片上可见β-淀粉样蛋白沉积和神经元缠结年龄每年每千人新增患者65–69

370–74

675–79

980–842385–894090–

69细胞坏死(necrosis,“deadness”)活的生物个体中出现的致命细胞损伤或者突然的细胞死亡。化学因素强酸强碱毒素物理因素高热辐射生物因素病原入侵缺氧失血餓食我starvationself-eating细胞自吞噬(autophagy)通过溶酶体降解细胞自身组分的分解代谢过程。曾经被称为II型程序性细胞死亡。细胞自吞噬之父

（溶酶体，LYSOSOME）TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1974".

N.

NobelMediaAB2013.Web.3Oct2013.

细胞自吞噬是个体正常发育所需父系线粒体的消失胚胎着床新生小鼠的存活脂肪细胞分化细胞自吞噬是细胞应对外界刺激所需营养元素和生长因子缺失错误折叠的蛋白质受损伤的细胞器侵入细胞内的病原微生物脂稳态的维持为什么需要启动自吞噬程序？TumorsasComplexTissuesThetumormicroenvironmentisregulatednotonlybycancercellsbutalsobyendothelialcells,immunecellsandstromalelements

------HanahanD,WeinbergRA.Cell,2000.

(四)肿瘤良性肿瘤与恶性肿瘤MolecularbiologyofthecellTumorinvasion-metastasiscascade（肿瘤侵袭转移）Molecularbiologyofthecell肿瘤是遗传突变的结果

Alterationinthecell'sDNAsequence

Epigeneticchange:achangeinthepatternofgeneexpressionwithoutachangeintheDNAsequence

物理致癌物质，例如紫外线和电离辐射化学致癌物质，例如石棉、烟草烟雾成分、黄曲霉毒素（一种食品污染物）和砷（一种饮水污染物）生物致癌物质，例如由某些病毒、细菌或寄生虫引起的感染。癌症源自一个单细胞。从一个正常细胞转变为一个肿瘤细胞要经过一个多阶段过程，通常从癌前病变发展为恶性肿瘤。这些变化是一个人的基因因素和三种外部因素之间相互作用的结果，这些外部因素包括：WHOwebsiteMolecularbiologyofthecell乳头瘤病毒乙肝病毒白血病病毒艾滋病病毒丙肝病毒疱疹病毒ZhouBB,etal.Nat.Rev.DrugDiscov.2009.Cancerstemcells(CSCs),alsoknownastumorinitiatingcellsortumorigeniccells,refertoasmallsubsetoftumorcellsthathavestem-likecellproperties,theabilitytoself-renew,differentiateintoheterogeneouspopulationsofcancercells,andseednewtumorsinaxenotransplantsystem.Cancerstemcell(肿瘤干细胞）针对肿瘤特征的治疗策略Weinbergetal.,Cell2012第二节动物细胞工程一、动物细胞培养无菌室无菌操作台二.单克隆抗体

1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。现代医学三大支柱：工程蛋白质和抗体小分子化合物细胞疗法（人类和微生物细胞）单克隆抗体的应用分子细胞生物学基础研究疾病的定向治疗（肿瘤免疫疗法，风湿性关节炎等）疾病的早期诊断超过150亿美元的市场FDA已批准超过30种单抗药物三.动物克隆生物学上，克隆指的是低等生物无性繁殖产生遗传信息完全一致的群体的自然存在的过程。生物技术领域，克隆指的是复制（拷贝）DNA片段（分子克隆），细胞（细胞克隆，应用于干细胞）乃至生物体（生殖克隆）的手段。生殖克隆一般指创造遗传特性上完全一致的多细胞个体的过程，是一种无性繁殖。人为创造：体细胞核移植，利用显微外科技术，将一个体细胞核移植到一个去核的卵细胞中，再植入母体子宫，便可不经受精而发育。胚胎分裂（胚胎孪生）自然存在：个别雌性昆虫，甲壳类和蜥蜴成熟个体的复制克隆研究的历史及现状Hansspemann,1869-19411928年进行了首次核移植实验1935年获诺贝尔生理医学奖1938年预言了克隆高级生物的可能性德国胚胎生物学家（thefatherofcloning）

1962年JohnGurdon用肠细胞（分化终末细胞）核克隆青蛙JohnGurdon(1933-)紫外线照射未受精卵移核卵蝌蚪提取肠上皮细胞核注入细胞核蝌蚪囊胚囊胚不分裂畸形胚成蛙细胞可以“重编程”克隆技术的基础July5,1996~February14,2003多莉(Dolly)RoyalMuseuminEdinburgh,Scotland1996年7月5日第一个用成年体乳腺细胞克隆产生的哺乳动物——绵羊多莉（Dolly）诞生Wilmut,A.E.Schnieke,J.McWhir,A.J.KindandK.H.Campbell.Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells.Nature,1997,385:810–813.Long-sought.Clonedhumanembryos,whichcanbeusedtomakepatient-specificstemcelllines.HumanCloningatLast2013十大科学进展胃育溪蛙首次利用核移植技术复活八十年代灭绝动物——20131.什么是干细胞?四.干细胞工程Stemcellsaredefinedasundifferentiatedcellsthatarecapableofboth(1)self-renewal,thatis,productionofcellslikethemselves,and(2)commitment,thatis,productionofcellsthatarecommittedtodifferentiation.innearlyallanimals,fromtinywormstomiceandhumans.

胚胎干细胞（embryonicstemcells）

成人体内干细胞（adultstemcells）

诱导多能干细胞（inducedpluripotentstem(iPS)cells）2.干细胞的类型EmbyonicStemCellsVS.AdultStemCellsStemCells:FlexiblefriendsNature

483,

S22–S26Inthepastdecade,scientistshavealsolearnedtomakestemcellsfromregularmature,differentiatedcells.Thesecellsarecalledinducedpluripotentstemcellsbecausescientistsforcethemtobecomepluripotentevenaftertheyhavereachedadifferentiatedstate.

Byturninguptheexpressionofjustafewgenes,scientistscanforceaskincell,forexample,toretraceitsdevelopmentalpathwaybackwardsallthewaytoaflexiblepluripotentstate.

InducedPluripotentStemCells3.干细胞技术在医疗领域的运用皮肤细胞iPS神经细胞心肌细胞肝细胞精子、卵子基于造血细胞的治疗，糖尿病，肝病，神经系统和视网膜疾病，肌肉营养不良，心脏病，PeopleintheUSaffectedbydiseasesthatmaybehelpedbystemcellresearchCondition NumberofPersonsAffectedCardiovasculardiseases 58MillionAutoimmunediseases 30MillionDiabetes 16MillionOsteoporosis 10MillionCancer 8.2MillionAlzheimer'sdisease 4MillionParkinson'sdisease 1.5MillionBurns(severe) 0.3MillionSpinalcordinjuries 0.25MillionBirthdefects 150,000(peryear)Total 128.4Million--------------------------------------------------------------------------------------DatafromthePatients'CoalitionforUrgentResearch,Washington,DC(accordingtoPerry,Ref.267).Foxetal.,Science2014治疗用的干细胞从何而来?自然胚胎从成体组织直接分离得到（如血液、骨髓、脂肪）克隆人胚胎-核移植/混种胚胎-核移植体细胞诱导多能干细胞(体细胞转分化)"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2012".N.21Feb2013/nobel_prizes/medicine/laureates/2012/TheNobelPrizerecognizestwoscientistswhodiscoveredthatmature,specialisedcellscanbereprogrammedtobecomeimmaturecellscapableofdevelopingintoalltissuesofthebody.Theirfindingshaverevolutionisedourunderstandingofhowcellsandorganismsdevelop.JohnB.Gurdondiscoveredin1962thatthespecialisationofcellsisreversible.TheDNAofthematurecellstillhadalltheinformationneededtodevelopallcellsinthefrog.Woulditeverbepossibletoturnanintactcellbackintoapluripotentstemcell?细胞功能的特化是一个可逆的过程ShinyaYamanakadiscoveredmorethan40yearslater,in2006,howintactmaturecellsinmicecouldbereprogrammedtobecomeimmaturestemcells.Surprisingly,byintroducingonlyafewgenes,hecouldreprogrammaturecellstobecomepluripotentstemcells,i.e.immaturecellsthatareabletodevelopintoalltypesofcellsinthebody.如何使分化终末细胞回复干细胞特性TheraputicCloningofStemCells

forTreatmentofHumanDisorders据英国《自然》杂志网站2014年9月11日报道，治疗使用的iPS细胞由日本神户理化研究所（RIKEN）发育生