基因工程研究策略和实践课件

基因工程研究策略基因决定性状青霉素能产生青霉菌家蚕能吐出蚕丝为人类利用定向改造基因的设想1.能否让细菌“吐出”蚕丝？2.能否让微生物产生人胰岛素、干扰素等昂贵药物？经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物DNA的技术-基因工程基因工程过程示意图①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③提取大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因/使其表达③③基因工程的研究策略一、目的基因的分离(donorDNA)二、载体DNA及其改造(VectorDNA)三、体外DNA重组(DNArecombination)四、重组DNA的转化(Transformation)五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增

(identification&cloneamplification)六、目的DNA在受体细胞中的表达(geneexpression)一、目的基因的分离从cDNA文库中分离目的基因从基因组DNA文库中分离目的基因PCR扩增目的基因片段化学方法人工合成基因cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合2.从基因组DNA文库获取目的基因包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况4.化学合成法获取较短的目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列二、载体DNA载体

(Vector)载体是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。常用载体

质粒病毒载体噬菌体

粘性质粒/粘粒

载体的选择标准有复制起点，能自主复制；具有筛选标记，便于重组体的筛选和鉴定；具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；分子量小，以容纳较大的外源DNA。表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。穿梭载体(shuttIevector)

又称双功能载体(bifunctionalvector)。能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体。其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。如pKSV一10、pJDB219载体等。载体的分类-按来源分

质粒(plasmidvector)病毒(virusvector)噬菌体(phagevector)粘性质粒/粘粒(cosmidvector)

1.质粒载体:

(1)分子量较小，在细菌中有较多的拷贝数。(2)松驰型。

(3)具有一个以上的标志，便于筛选。(4)具有数个或一个单一的酶切点。

天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是pBR322,pUC19.，2．病毒载体（1）整合型载体：外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。（2）游离型载体：能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如：腺病毒。3.λ噬菌体载体

现用的λ噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的。改建之后的常用载体有两类：①插入型载体，具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，只能插入较小的外源DNA片段(＜10kb)。如λgt10、λgt11；②替换型载体，具有成对的克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段可被外源插入的DNA片段取代，能插入较大的外源DNA片段(20-24kb左右)。如charon4、charon10。4.

Cosmid质粒

由λDNAcos区与质粒重组建造而成。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。

分子量小（约4—6kb），可容纳大至40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库。

如cosmidpHC79限制性内切酶―“分子剪刀”Ⅱ型限制性内切酶，能专一地识别DNA分子上特定的碱基序列并将DNA切断的内切酶。识别序列的特点；(I)专一；(2)常由4–6个碱基组成；(3)具有回文序列经切割可以生成平头末端或粘性末端。可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体2.平齐末端连接优点：可连接任何一对DNA可恢复一个酶切位点或产生一个新酶切位点缺点：连接率低要求连接酶及底物浓度高GAAＴＴＣＣＴＴＡＡＧGAAＴＴＣ

3.同聚物核苷酸末端法

在DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。应用末端转移酶在DNA片段3′末端制备粘末端。避免自身环化互补序列较长时（>4bp)，不需连接酶

4.T-A克隆T-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中增加延伸时间，Taq酶可在产物的3’端多加一个A受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)四、重组DNA的转化1.基本概念转化（transformation）：把以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。转染（transfection）：以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程。感染（infection）：病毒或重组病毒DNA进入细胞的过程。转化子：又称工程菌，即接受了重组DNA的受体菌。2.受体细胞感受态感受态(competent)

：细胞最易摄取和“容忍”外来DNA的生理状态。致敏：诱导细胞进入感受态的操作。３．转化动物细胞常用的方法

1.磷酸钙共沉淀法；2.DEAE-葡聚糖或聚阳离子促进吸收法；3.脂质体转染法；4.电穿孔法；5.病毒转染法；6.显微注射法。

五、重组体筛选、鉴定与克隆扩增平板筛选插入失活插入表达电泳筛选PCR筛选核酸杂交DNA测序免疫学检测法1.常用筛选/鉴定阳性重组体的方法初步筛选精确鉴定表型鉴定1.平板筛选法（1）插入失活（insertionalinactivation)：

在载体某个基因序列的限制性内切酶位点上插入外源DNA后，使该基因失去活性，从而不能表达其相应的功能。常以此现象作为标记，筛选被这种重组体转化的细胞。(插入失活法)抗药性标记选择1.

Amps

Tets

（转化失败）2.

Ampr

Tetr（转化成功，但仅转入载体，无重组）3.Ampr

Tets

（转化、重组均成功）（2）插入表达（insertionalexpression)载体设计时，在筛选标志基因前连接一段负调控序列（抑制作用），当目的基因在此插入时，使其对下游的抑制作用丧失，从而下游的筛选标志得到表达。CI为负控制序列（抑制Ter表达）当DNA插入使CI失活Ter表达，由此作为阳性克隆的筛选。

2.酶切-电泳法筛选

经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后再抽提出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割，电泳后根据DNA分子大小不同，鉴别真正重组体DNA，排除假阳性和载体自我连接载体双重体。

该法不能鉴别插入片段大小相似的非目的基因片段的假阳性。

联合酶切鉴定同源末端连接重组子中DNA插入片段的方向ＢＢ3.PCR法筛选

提取重组质粒DNA，用已知的特异引物扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测有无相应电泳带。4.核酸分子杂交（hybridization）两条不同来源的含有互补核苷酸序列的单链核酸分子，通过碱基配对规律形成一个新的稳定的双链核酸分子的过程菌落原位杂交（HybridizationinSitu）（以细菌为受体细胞）使用与目的DNA互补的探针鉴别阳性转化菌菌落原位杂交法筛选复印至硝酸纤维素膜上用NaOH菌体裂解DNA变性杂交放射自显影32P-cDNA与放射性cDNA杂交的菌落的斑点细菌菌落单链DNA结合到膜上5.DNA测序测序：确定DNA链上确切的碱基顺序方法：对初步筛选的阳性重组子，扩增后抽提质粒，酶切回收片断，进行DNA测序确认。

6.免疫学检测法鉴定表达产物

依据抗原、抗体特异性结合反应的原理，以单克隆抗体对表达产物进行特异性检测。六、目的DNA在受体细胞中的表达基因工程表达系统大肠杆菌系统枯草杆菌系统酵母细胞系统昆虫细胞系统哺乳动物细胞系统原核表达系统真核表达系统基因工程操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体基因工程的实践1.利用重组酵母生产乙肝疫苗

乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能生长，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但其大规模生产受到病毒表面抗原来源的限制，而且提取物需要高度纯化，纯化过程中往往会发生失活现象。此外，最终产品还必须严格检验其中是否混有病人的致病病毒。所有这些工序导致制造成本高居不下，因此这种传统的乙肝疫苗生产方法不能满足几亿接种人群的需求。乙醇氧化酶基因(aox1)启动子可帮助该质粒整合到特定染色体位点的序列(3’-aox1)His合成过程中所需的组氨醇脱氢酶基因(his)图10-12宿主采用组氨醇脱氢酶缺陷型(HIS4－)的P.pastoris，经双交换整合重组后，染色体上的aoxl丢失，而整合入aoxl启动子—HBsAg-aoxl终止子及加poly(A)信号序列、his4和3'aox1。整合后的细胞可在不含His的培养基上生长在酵母细胞中，这种蛋白能像在受乙肝病毒侵染的人体细胞中那样，组装成多亚基的复合物，能诱导产生抗