转基因抗病植物安全性课件

转基因抗病植物安全性分析Email:cn一、转基因作物及其产业化发展DNA双螺旋结构(1953)DNA体外重组(1973)转基因烟草(1983)转基因作物的商业化(1996-至今)转基因作物的应用和安全性已成为全球关注的焦点。转基因作物=遗传修饰作物转基因作物指通过现代生物技术获得遗传物质新组合的植物转基因作物全球种植的面积

不同转基因作物在全球种植的面积

不同性状的转基因作物在全球种植的面积

商业化种植的GM作物作物性状大豆除草剂耐性棉花抗虫性,除草剂耐性玉米抗虫性,除草剂耐性油菜除草剂耐性甜菜除草剂耐性番木瓜抗病毒南瓜抗病毒水稻抗虫2005年种植的主要转基因作物百万公顷%耐除草剂大豆54.460抗虫玉米11.313抗虫和耐除草剂玉米6.57抗虫棉4.95耐除草剂油菜4.65抗虫和耐除草剂棉花3.64耐除草剂玉米3.44耐除草剂棉花1.32合计90.0100种植转基因作物的国家转基因作物:里程碑2005转基因作物商业化种植的第一个十年第一次种植面积超过亿公顷(400millionthhectare)转基因作物的益处BrookesandBarfoot(2005)农民纯经济收益$2.7亿农药用量减少172百万公斤减少与农药相关的环境污染14%减少温室气体排放1亿公斤二、转基因产品安全性问题

食品安全性环境安全性贸易壁垒过敏性与已知过敏物质的相似性动物模型评价营养组分和饲料性能试验“转基因食品对健康的潜在直接影响是对比常规食品已知的风险，包括现存组分过敏性和毒性的潜力，营养品质和食品的微生物安全性。(WHO,2005)基因漂移 -与近缘杂草杂交及新杂草的产生 -水平基因漂移 -与常规作物共存性对非靶标的影响 -专化性的概念昆虫抗性的产生 -庇护所环境的关注点:潜在风险在转基因作物释放前评价其对环境和生态的潜在影响需要对批准后的监测和良好的农业系统以检测并使潜在的风险最小化，并确保转基因作物在释放后继续使安全的环境的关注点:潜在风险表现是可信的、非误导的和可核实的要求:标准、检验、证书化和强制不同国家有其不同的标识制度有相应的成本标识:标识制度从生物技术获得益处需要做什么?以科学为基础的评价与管理策略

-食用安全

-环境安全

适合的政策环境

平衡的公众拥护转基因作物对增加农产品产量是有益的需要一种以科学为基础的管理体系来评价转基因作物的食用和环境安全性公众的接受性是个关键因素三、抗病毒转基因植物及其安全性

自1986年Powell等首次报道将烟草花叶病毒的外壳蛋白（CP）基因转入烟草以来，世界各国的已相继开展了许多抗病毒转基因研究工作：导入病毒外壳蛋白基因；导入病毒的卫星RNA（SatRNA）；导入病毒非结构蛋白基因，如复制酶、MP基因；利用的缺损干扰(DI)颗粒；利用植物本身的抗病毒基因和利用动物中的干扰素(interferon)基因；利用反义RNA技术；利用中和抗体法技术；设计核酶剪切病毒RNA等。交互保护的分子基础

从某种意义上讲，利用病毒外壳蛋白基因进行抗病毒工程是交互保护研究的继续。交叉保护现象早在1929年由Mckinney报道预先感染(自然或人工接种)了温和的、无症或弱病毒株系的田间作物(烟草、蕃茄、苹果、木薯等)可以在一定程度防御与之亲缘关系较近的强毒株系病毒的侵染。70年代又发现在类病毒中也存在交叉保护现象。但是类病毒是一类长246－399个碱基、裸露的环状单链RNA病原体，与病毒不同。两种不同类型的病原体分子都具有交叉保护作用，这是一个有重要意义的问题。

转CP基因抗病毒基因工程成功的实例：夏威夷转基因番木瓜及其安全性（2）抗病毒的其他策略复制酶基因介导的抗性移动蛋白基因介导的抗性卫星RNA介导的抗性核酶基因介导的抗性RNAi介导的抗性植物的抗性基因介导的抗性

对抗病毒转基因植物而言，其潜在风险主要包括病毒重组（Recombination）可能产生新病毒，病毒间的异源包装（Transcapsidation）导致寄主范围或介体种类的扩大，病毒来源的转基因植物与其它病毒发生协同危害（Synergism）、卫星RNA毒性突变性（Mutability）等方面。（二）抗病毒转基因植物对生态环境的潜在风险

1、病毒基因重组产生新病毒的可能性病毒重组主要指转基因植株的mRNA与另一种侵染的病毒发生遗传物质重组而产生新病毒的可能性。这种风险在所有的抗病毒基因工程策略中，都有可能产生。在自然条件下，植物病毒有很多机会进行遗传上的交流，植物容易受多种病毒侵染，使得不同病毒的遗传物质有可能发生交换。病毒之间的重组，或相似核苷酸之间的交换，都可导致新病毒产生。如1988年在乌干达就严重流行一种称为木薯花叶病毒乌干达变异株（Ugv）的新病毒，造成了严重的饥荒，经分析研究其外壳蛋白（CP）是由两种不同血清型的木薯花叶病毒即非洲木薯花叶病毒（ACMV）和东非木薯花叶病毒（EACMV）重组而产生的。在抗病毒转基因植株内，会发生转入的病毒外壳蛋白（CP）基因与感染病毒的相关基因之间交换核苷酸。

在病毒进化过程的研究中就发现长线形病毒属（Closterovirus）的基因组与植物热休克蛋白基因类似，可能是由寄主植物的mRNA与一种古老病毒的基因组在进化过程中重组产生的。Mayo等（1991）发现叶绿体mRNA的序列会结合到马铃薯卷叶病毒（PLRV）的5，非编码区，这意味着寄主mRNA与病毒基因组重组的可能发生。因此，在田间环境下，本来不侵染某植物的病毒与能侵染的病毒之间发生重组的可能性是存在的。Greene和Allison（1994）指出对抗病毒转基因植物进行风险评估时，应考虑到RNA的重组问题，认为RNA的重组有可能引起新病毒的产生。但也有相反的观点，如Falk和Breuning（1994）认为转基因植株中的RNA与野生病毒RNA基因组之间重组率很低。即便是发生了重组，新的重组病毒在整个病毒侵染周期的一系列过程中，也不会有更高的生活力。2、病毒（株系）间的异源包装使寄主范围可能会扩大异源包装也称为异壳装配作用，是指寄主植物中形成的病毒粒体系由一种病毒的核酸和另一种病毒的外壳蛋白所组成，导致病毒传播特性和寄主范围的改变。这种危险性仅存在于转病毒外壳蛋白基因的工程植株中。病毒的异壳装配作用可使寄主范围扩大，但只是暂时现象。因为异壳作用产生的新病毒到达新寄主后，进行自身遗传物质的复制，并产生新的衣壳，结果产生的病毒后代依然是原来的病毒类型，仍保持原有的寄主范围。

在自然条件下，不同病毒（株系）间异源包装现象是存在的。Rochow（1970）发现当BYDVMAV株系与RPV株系共同侵染时，RPV的核酸被MAV的外壳蛋白包被，使原来麦长管蚜不能传播的RPV变得能够传播。Chen和Francki（1990）曾报道，黄瓜花叶病毒（CMV）的衣壳蛋白包装烟草花叶病毒（TMV）基因组，结果原先不能被昆虫传播的TMV可以被昆虫传播，引起烟草花叶病发生。Farinelli等（1992）报道，含一种马铃薯Y病毒属病毒的CP基因的转基因烟草，被另一种马铃薯Y病毒属病毒感染后，转基因作物上出现了两种病毒类型：除正常的感染病毒外，还有一种是由转基因植物合成的CP包装的病毒。3、病毒间的协同作用可能会使病毒病变得更加严重两种植物病毒共同侵染产生的协同危害（Synergism）作用早就被注意到，如PVX和PVY共同侵染马铃薯时产生的症状比两者单独侵染时严重得多。而且原来不能系统侵染植物的一种病毒，在植物受到另一种病毒侵染后变得能够系统侵染，如Taliansky等（1995）报道番茄不孕病毒（TAV）单独侵染黄瓜时仅局限在接种的叶片，但在CMV存在的情况下就能够系统侵染，造成这种现象的原因是CMV的MP介导了TAV的系统侵染。

Vance等（1995）发现任何一种PVY属病毒的辅助成分-蛋白酶（HC-Pro）基因会与PVX发生协同作用。因此，抗病毒转基因植物中病毒基因产物与其他病毒或病毒产物之间的相互作用，可能会加速病毒病的发展，或者产生病毒的协同作用。在大规模种植转卫星RNA的转基因植物时，意味着大量复制卫星RNA。在某些辅助病毒（helpervirus）自然侵染过程中，二者之间就会发生包衣壳作用。卫星RNA与辅助病毒之间的相互作用，有可能产生新的病毒病或加重已存在的病症。如Wilson（1993）认为，致弱的卫星RNA非常有可能突变成增强其辅助病毒的卫星RNA，因此在基因工程中的作用不大。4、毒性突变性（Mutability）的危险在利用卫星RNA的抗病毒基因工程中还存在毒性突变性的危险。Harrison等（1987）发现在CMV卫星体系中，基因工程植株包含一种弱毒变株CMV卫星RNA的全长cDNA拷贝。CMV侵入后该转录子可以复制形成单个的卫星RNA，寄主内繁殖的CMV粒体就具有这个卫星RNA，并能被蚜虫传播到其他的植株中去。危险性在于该卫星RNA在一种寄主（如烟草）是弱毒的，但在另一种寄主（如番茄）就可能是强毒性的。况且弱毒和强毒性卫星RNA的序列差异很小，如点突变就可使一非坏死株系变成坏死株系。这就意味着源于cDNA插入的弱毒卫星RNA发生毒性的改变。5、相互干扰（Interference）的危险当一种抗病毒转基因植物具有两种以上的病毒源基因时就可能发生基因间的相互干扰作用。如分别转入TVMV的3个基因（NIa、NIb和CP）的抗病毒烟草品系，通过杂交把这3个基因同时组合到一起时，就重新变成感病。因此，源于同种病毒的不同基因介导的转基因品种大规模种植时，它们之间的相互杂交就可能使其后代含有两种或两种以上的病毒基因，从而导致抗病性的丧失。四、抗细菌转基因植物安全性分析

以转Xa21基因的抗白叶枯水稻为例

我国的转基因水稻处于世界先进水平，研发的一些抗病、抗虫转基因水稻已经进入申请生产用生物安全证书阶段，但主要由于转基因生物安全问题等原因，商业化种植及其缓慢。2009年农业部批准了Bt汕优63在湖北省的商业化证书，引起了社会极大关注。水稻白叶枯病及病原菌水稻白叶枯病Ricebacterialblight水稻,Oryzaesativa水稻黄单胞菌水稻致病变种Xanthomonasoryzaepv.oryzae（Xoo）水稻白叶枯病Ricebacterialblight抗白叶枯病基因Xa21的利用目前已从水稻中发现了29个抗白叶枯病基因，已克隆了其中6个抗性基因：Xa1、Xa21、Xa26、xa5、Xa27、xa13。Xa21基因：来自于长药野生稻，对Xoo的多个小种或致病型有广谱抗性。抗病育种的研究热点：Xa21基因的利用我国已有许多学者利用转基因技术将Xa21基因导入不同水稻品种中，从而使这些品种获得了对白叶枯病的抗性。转基因作物安全性评价的主要内容环境安全性食用安全性分子特征1.转化材料2.转化方法3.外源插入DNA结构4.转录和表达5.遗传稳定性6.检测和鉴定1.杂草性2.基因漂流3.对生物多样性影响4.其它环境问题1.毒性2.过敏性3.营养水平4.抗生素标记基因5.其它问题包括外源插入DNA结构在内的分子特征分析既是全面的环境安全性和食用安全性评价的一个重要组成部分，也是进一步开展具体的环境和食用安全性评价的分子基础。（一）转基因抗白叶枯水稻抗优97的外源DNA插入结构分析分析外源插入DNA在受体水稻基因组中的结构；建立品系特异性的检测方法；分析外源插入DNA可能的整合规律；在插入结构水平上探讨其安全性。主要研究内容转化质粒pC822(Xa21

gene)

pHX4(

hphgene)转基因成分检测35ShptNOSkanXa21--+++35SNOSkanhptXa21pHX4pC822NOS位点kan位点NOS位点pHX4NOSTAIL-PCRpHX4NOS载体序列+缺失270bp的hpt基因、NOS终止子+载体序列hpthptNOSKan位点L1位点L2位点启动子区域缺失473bpL1位点L1-1L1-2L2位点L3位点L4位点L2位点TAIL-PCR20个重组片段重组片段的扩增重组片段间的连接LD-PCR单元1单元2重组片段结构2个重组单元9个重组片段重组片段间遗传关系分析表明，这些重组片段是位于一个重组单元内的。（1）外源插入DNA的整体大小转Xa21基因水稻“抗优97”的外源插入DNA大小推测为数百kb。A.已经测定的外源插入DNA序列长度为73kb；B.这些转基因序列位于一个分离单元内。结论（2）转基因位点的结构特征A、重组片段小于200bp的占约2/3。B、64个重组片段中，53个来源于转化载体，6个来源于水稻基因组，5个为FillerDNA。C、重组片段之间具有微同源性。72个片段连接位点中有64个具有微同源性。D、重组断裂位点在转化载体pC822上是随机分布的。（3）特异性检测方法的建立基因构造转化事件转化质粒构建L2重组位点（二）转基因抗白叶枯水稻抗优97的对环境微生物的影响转基因作物的生存竞争力，如入侵性、竞争性、杂草性等转基因作物的基因漂流转基因作物对靶标和非靶标生物的影响转基因作物对生物多样性的影响其它环境安全性问题转基因性状转基因作物研究方法研究微生物参考文献抗除草剂草甘膦油菜培养、DGGE根际细菌群落(S.D.Siciliano1999)抗除草剂油菜FAME、Biolog根际细菌群落(KariE.Dunfield2001)Basta抗性油菜DGGE根际Pseudomonas、Eubacterial群落(StephenGyamfi2002)抗除草剂草甘膦油菜Biolog、FAME、T-RFLP土壤微生物群落(KariE.Dunfield2003)α淀粉酶和转木质素过氧化物酶基因苜蓿Biolog、DNA指纹图谱、微生物呼吸作用土壤细菌、真菌、线虫、原生动物、微小节肢动物(DoneganK.K.1999)木质素过氧化酶基因苜蓿Biolog、ERIC-PCR根际细菌群落(G.D.DiGiovanni1999)GUS基因和Barnase/Barstar雄性不育基因马铃薯T-RFLP土壤细菌群落(ThomasLukow2000)凝集素伴刀豆蛋白A(ConA)和雪花莲凝集素(GNA)马铃薯Biolog土壤细菌群落(GriffithsB.S.2000)T4溶菌酶马铃薯培养产生吲哚乙酸的有益细菌、抗生细菌(JanaLottmann1999)T4溶菌酶马铃薯培养、DGGE接种的抗生细菌、根际细菌群落(JanaLottmann2000)T4溶菌酶马铃薯染色和荧光显微镜根表面的B.subtilis(IngridAhrenholtz2000)T4溶菌酶马铃薯培养、FAMEBiolog、DGGE土壤和根际微生物(HolgerHeuer2002)T4-溶菌酶马铃薯FAME、Biolog、DGGE叶围细菌群落(HolgerHeuer1999)国外关于转基因作物对环境微生物影响研究的现状主要研究角度和研究方法研究角度研究方法定性研究（群落结构）培养Biolog、FAME、微生物呼吸作用非培养（分子）DGGE/TGGE、T-RFLP、ERIC-PCR定量研究（类群数量）选择性培养基（抗生素标记细菌）染色和荧光显微镜（荧光标记细菌）环境微生物的特点：不可培养、分类计数困难转基因作物对环境微生物影响抗除草剂油菜对根际土壤微生物的影响转T4溶菌酶基因马铃薯对土壤和根际微生物的影响转T4溶菌酶基因马铃薯对叶围微生物的影响研究方法研究微生物参考文献FAME、Biolog土壤根际细菌群落(KariE.Dunfield2001)对根际微生物群落结构有影响（1998-1999）FAME、Biolog、T-RFLP土壤根际细菌群落(KariE.Dunfield2003)影响是暂时的，不会延续到下一个生长季节（2000-2001）抗除草剂油菜对根际土壤微生物的影响转T4溶菌酶基因的马铃薯对土壤和根际微生物的影响采用方法研究的微生物参考文献培养产生吲哚乙酸的有益细菌、对E.carotovora和V.dahliae的拮抗细菌(JanaLottmann1999)与在环境中的自然变异相比，影响不大。培养、DGGE接种E.carotovora和V.dahliae的拮抗细菌、根际细菌群落(JanaLottmann2000)在T4溶菌酶表达量最高时拮抗细菌数量有差异，但细菌群落结构在接种和非接种的马铃薯之间没有差异。采用方法研究的微生物参考文献染色和荧光显微镜根表面的B.subtilis(IngridAhrenholtz2000)转基因植株的杀伤力比非转基因植株高1.5-3.5倍培养、FAMEBiolog、DGGE土壤和根际微生物(HolgerHeuer2002)没有发现根际群落有偏差，是季节、田块的位置或年份相关的环境因子而不是转基因植物表达的T4溶菌酶影响了根际群落转T4溶菌酶基因的马铃薯对土壤和根际微生物的影响方法研究微生物参考文献FAME、Biolog、DGGE叶围细菌群落(HolgerHeuer1999)两者群落高度相似，在可培养细菌的种类构成上有不同，但小于自然波动产生的差异。转T4-溶菌酶基因马铃薯对叶围细菌群落影响

研究方案转Xa21基因水稻对叶围靶标和非靶标细菌的影响非靶标细菌数量和结构对靶标菌（Xoo）的影响对非靶标细菌的影响Xoo菌群数量和结构Xoo的常规和分子鉴定分类方法环境微生物的常规和分子研究方法

材料：

白叶枯病菌C2、C4、C5

转Xa21基因水稻抗优97、受体水稻皖A、常规水稻汕优63方法：

剪叶法：侵染部位的增殖能力喷雾法：健康叶片上的定殖能力

1、温室条件下水稻叶面白叶枯菌的动态变化转基因水稻中Xa21基因的PCR检测M123M：DL20001：转Xa21基因水稻2：受体皖A3：汕优631.4kb田间

（2003.8武汉）转Xa21基因水稻对白叶枯病的抗性温室（2003.7北京）受体皖A转Xa21基因水稻汕优63剪叶接种侵染部位白叶枯病菌的动态变化

C2C4C5对照喷雾接种白叶枯病菌的动态变化C2C4C5对照材料：转Xa21基因水稻、受体水稻皖A、汕优63地点：湖北农科院植保土肥所试验田连续第二年种植转基因水稻，两年小区设计相同，12个小区，每个水稻材料4次重复，每个小区50M22、田间条件下转Xa21基因水稻的叶围细菌研究

LK

JIH

GFED汕优63C转基因B受体皖AA田间取样降雨田间实验（武汉）12个小区细菌总量行12341----0.1410.5330.4682----1.3680.4913----1.2814----列1231----1.6670.0352----3.3183**----品种受体转基因汕优63CK----2.0501.358TR*----1.15263----

行间没有显著性差异，列间第2列与第3列有极显著性差异，转基因水稻和受体水稻间有显著差异，但比较前3行的9个小区时，它们则没有显著差异。田间水稻叶面细菌总量随取样时间的变化

不同时间叶面细菌总量的t测验

63-163-263-363-463-563-663-1----0.9570.7473.08212.4578.45763-2----0.2962.77912.4918.14763-3----2.1545.9665.29963-4***----1.8591.88263-5******----0.34563-6******----CK-1CK-2CK-3CK-4CK-5CK-6CK-1----0.7180.1800.9192.9762.864CK-2----0.7531.6243.5013.406CK-3----1.6247.3258.496CK-4----2.4042.262CK-5******----0.645CK-6******----汕优63TR-1TR-2TR-3TR-4TR-5TR-6TR-1----1.5192.6950.0342.6011.460TR-2----2.7672.09410.1945.547TR-3**----3.4328.8186.127TR-4***----3.5301.914TR-5*******----1.639TR-6****----受体皖A转基因水稻水稻叶围细菌总量因取样时间而异。水稻材料间叶面细菌总量的t测验

CK-1TR-163-1CK-1----0.5421.161TR-1----0.34263-1----CK-2TR-263-2CK-2----0.3712.746TR-2----0.83463-2**----CK-3TR-363-3CK-3----3.1710.371TR-3**----3.11263-3**----CK-4TR-463-4CK-4----0.4611.137TR-4----0.58263-4----CK-5TR-563-5CK-5----0.3830.714TR-5----0.31863-5----CK-6TR-663-6CK-6----1.1891.390TR-6----0.61963-6----第一次第二次第三次第四次第五次第六次不同品种间差异不显著。水稻叶围细菌的分子鉴定叶围样品LB平板挑取单菌落形态分类提取DNAITS-PCR克隆测序比对鉴定序列比对鉴定流程ITS23SrRNA在GenBank上进行blast搜索相似高的搜索结果得到菌株的分类信息tRNA在EuropeanribosomalRNAdatabase中搜索得到菌株的分类信息相似高的搜索结果110bp类型培养参数颜色形状大小边缘突起分化表面透明度A28℃/72hr黄色圆形中光滑扁平无光滑不透明B白色奶油圆形中光滑扁平无光滑不透明C灰白色圆形较大光滑扁平无光滑不透明D白色圆形小光滑扁平无光滑不透明E红色圆形中光滑扁平无光滑不透明F金黄色圆形较大光滑扁平无光滑不透明G白色圆形中光滑突起无皱褶蜡质H灰色圆形大光滑扁平无皱褶胶质I灰白色不规则大光滑扁平无光滑胶质J白色圆形大光滑扁平无光滑不透明K黄色圆形大光滑帽状无光滑不透明L土灰色圆形中光滑扁平无环形不透明水稻叶围菌株的形态分类菌株ITS的序列的克隆测定

MABCDEFGHIJKL

MABCD