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文档简介

基因工程克隆方案设计基因工程实验设计1、目的基因的序列分析2、载体的选择和分析3、克隆策略的设计4、引物的设计载体的选择和分析1、根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其它用途。2、MCS(多克隆位点）是否有合适酶切位点（一般是基因上没有或1个的酶切位点)3、表达载体，要注意表达框架配对。4、载体的酶切位点，用于重组鉴定。克隆策略的设计1、平端克隆；2、粘端克隆

（1）

TA克隆（2）单酶切不定向克隆（3）双酶切定向克隆

平端克隆机械打断，化学合成，EcoRV酶切，或其它酶切位点末端改造（klenow酶补平，S1处理）产生平端；克隆效率较低，ligase要加大量；载体需脱磷；方向可正可反。单酶切不定向克隆载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）；基因插入可正可反，需要筛选。双酶切定向克隆类型：

（1）粘-粘连接：最有效、最快捷（2）粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平特点:(1)基因和载体都用两种酶切割；(2)连接效率高；(3)外源基因插入方向固定，不用鉴定。引物的设计常规设计原则特殊用途设计技巧引物常规设计原则1.长度：１５～３7nt,一般２０nt左右;(仅binding,不含接头)2.G+C含量４０％～６０％3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；4.引物自身不能互补（<3个）5.引物之间不能互补（<5

个）6.引物３端不能错配,不能修饰，尽量不用A,不能超过３个连续的G或C；7.５端可变化修饰，附加酶切位点；8.两引物的Tm值应比较接近；9.正链引物：mRNA序列照抄；负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。１０．解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)[=<20nt]Tm=81.5+0.41*(GC%)-600/L[>20nt]Tm一般５５℃～８０℃［５５℃～５８℃最佳］PCR反应中结合温度（anneaningtemperature）T=Tm-5℃5’附加酶切位点(定向克隆)1、不同酶的保护碱基序列不同；NEBcatalog提供相关资料。2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序:

Nde1EcoR1引入点突变1.一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.2.突变位点要靠近5’端.3.要注意密码子的偏好性,简并性有不确定序列－－（2种）5’ATGGGC

A

CCATAGCTTCTA(A/C)C3’说明：1,表示该位点有两种可能的序列A或C;2.合成引物时只要一条引物的money;实际得到的是两条引物等比例的混合物：5’ATGGGC

A

CCATAGCTTCTAAC3’5’

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