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荧光定量PCR原理及实验步骤i=j、实时荧光定量PCR原理常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。几个概念：（1）扩增曲线：EuaQ®日三』黄州醐帝扩增曲统图;EuaQ®日三』黄州醐帝扩增曲统图;璧里标：扩增浦环数（Cybele）:觐坐标*荧光强度每个循环讲行一次荧光信号的收集（2）荧光阈值:5—%荧光信号阚值（threshold>:□前155—%荧光信号阚值（threshold>:□前15个褚环信号作为荧光本底信号（baselinej.瓯樟本的荧光背景值和明性对照的荧光僵□荧光域建刊旗省设置是个陆环的荧光信号的标准偏差的10借□丰劫设置=座则要大于样本的荧光背景值和阴性时照的荧光最高值.同时要尽呈选择拱.入指数期的最初阶携「并且保证回归系数大于0.99□真正的信号3荧光信号超过域值（3）Ct值:Ct值的定义:PCR扩增过程中’扩增产物的荧光信号达到设定的阚值时所经过的扩增循环次数（4）标准曲线□模板DNA量越多、荧光达到域值的循环数越少.即Ct值越小□Log浓度与循环数呈线性关系.通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值.就可以计算出样品中所含的模板量SYBRGreen工作原理：1、SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。,将温度与荧光强度的变化求导，［-dl/dT）Tm爵DNA醵黄一半时的温度,将温度与荧光强度的变化求导，［-dl/dT）Tm爵DNA醵黄一半时的温度□模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少融解南蛎分析，出现杂峰苴他产物出现非特异性荧

充，因］出定量不准或□Log浓度与循环数呈线性关系「根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量OfK4二、实验步骤实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。OfK41、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。计算好所有引物和SYBgreen的用量。2、反应体系（25UL）如下：h2o11uLSYBgreen12.5Ml上游引物0.25UL下游引物0.25ULcDNA1UL可先将H2O和S

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