硕士研究课现代分子生物学Molecularapproachesinbioremediation胡忠课件

Molecularapproachesinbioremediation

Bioremediation广义的生物修复，指一切以利用生物为主体的环境污染的治理技术。它包括利用植物、动物和微生物吸收、降解、转化土壤和水体中的污染物，使污染物的浓度降低到可接受的水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质，也包括将污染物稳定化，以减少其向周边环境的扩散。一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型。狭义的生物修复，是指通过微生物的作用清除土壤和水体中的污染物，或是使污染物无害化的过程。它包括自然的和人为控制条件下的污染物降解或无害化过程。生物修复技术与其他工程措施相比,具有费用低、就地处理、对周围环境干扰少等许多优点。本文综述了分子方法在生物修复中的应用，着重于根际修复（rhizoremediation）及其在降解含氯乙烯（chlorinatedethenes）中的应用。

Proteinengineering

定向进化（Directedevolution）是近20年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。

易错PCR是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。本法的关键在于选择适当的突变频率，当突变频率太高时，几乎无法筛选到有益突变；若突变频率太低，野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。费力、费时，且易出现同型碱基转换1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNAshuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株,其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍,也远高于易错PCR的突变筛选结果。DNA改组是基因在分子水平上进行的有性重组，是一种反复性突变、重组的过程。主要包括以下步骤：（1）目的DNA片段的获得；（2）目的基因的随机片段化，即将目的基因（可以是单个基因或一组相关基因）酶切成随机片段，这些随机片段集合包含了来自不同的同源序列的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同的3’末端，从而为下一步的无引物PCR提供了条件；（3）无引物PCR，即具有互补3’末端的寡核苷酸互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环，在不同模板上随机互补结合并进一步延伸；（4）有引物PCR，即以上轮无引物PCR的产物为模板，加入基因两端序列为引物，经过多轮PCR得到重排产物的集合，称为突变文库；（5）克隆、筛选、分析及多轮筛选，即进一步对突变文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮改组的模板，重复上述步骤进行多次重排和筛选，最终获得性状比较理想的突变体。与常规突变技术相比，DNA改组有以下显著优点：①DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb；②通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；③DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；④DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率。研究表明，DNA改组比随机突变具有较大的优势，随机突变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组可产生13%的良性突变。点饱和突变技术(site-saturationmutagenesis),是通过对目的蛋白的编码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。它不是定点突变技术的简单延伸,而是蛋白质设计理念的全面升华,广泛地应用于蛋白质改造及结构—功能关系研究中,并取得了一系列令人瞩目的成绩。如利用点饱和突变技术鉴定蛋白质功能位点,提高酶比活力,改善酶热稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性等多方面性质。目前已发展了多种点饱和突变方法,主要有以下几种：1、寡核苷酸定向诱变(oligonucleotide-directedmutagenesis)该方法于上世纪70年代末建立,将目的基因克隆到噬菌体M13单链表达载体上,然后合成一段在靶位点处含突变寡核苷酸的引物,使其与目的基因配对,再加入四种dNTP和KlenowDNA聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全长基因,获得的重组双链DNA分子转染细菌后大量复制,进而筛选出阳性突变子。该法突出优点是:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因内,通过噬菌体表面展示技术可方便地筛选出重组子。不足之处是:(1)对19种氨基酸须分别设计各自寡核苷酸引物,费用较大;(2)大肠杆菌宿主细胞存在自身修复系统,因突变修复而难以筛选出突变子;(3)不适合多点饱和突变。2、盒式诱变(Cassettemutagenesis)该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切位点序列的密码子盒(codoncassette)来引入突变序列。由于密码子盒可从正反两方向插入目的基因,因此只须11种密码子盒就可替换产生全部20种氨基酸以达到点饱和突变的效果。该法突出优点是:一个靶位点两侧的酶切位点经过改造可替换成其它氨基酸,相对于寡核苷酸定向诱变而言节省了引物合成的费用,而且可对多个非邻近位点同时进行点饱和突变。不足之处是:(1)每个靶位点两侧需分别设计酶切位点;(2)密码子盒两端存在重复序列,因自连而增加突变子筛选难度。2）、重叠延伸PCR(genesplicingbyoverlapextension)设计一对兼并引物,使其在靶位点附近有一定程度的重叠(图2中的B、C引物),分别与基因5′和3′端引物(图2中的A、D引物)组合,扩增含突变靶位点的上游片段和下游片段,然后将上下游片段在靶位点处交错,互为模板重叠延伸成全长基因。该法主要优点是:(1)能方便地对基因中间的靶位点进行点饱和突变,解决中间靶位点不易突变的难题;(2)突变与重组同时完成,大大缩短实验周期;(3)不存在突变修复问题,容易筛选出全部突变子;(4)可方便地进行多点饱和突变。不足之处是:当靶位点靠近目的基因末端时,分段扩增的片段过小而不易回收;分别扩增上下游片段时,不能使用具有无模板加尾性能的polI型耐热DNA聚合酶,而应使用无加尾性能的高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。图2重叠延伸PCR技术流程A、D分别表示基因上下游引物；B、C分别表示靶位点正反向突变引物；基因上的黑色区域为靶位点，NNN表示兼并引物或突变核苷酸3、质粒扩增诱变(mutagenicplasmidamplification)在靶位点处设计一对反向兼并引物,扩增质粒全长片段,然后用DpnI消化含甲基化位点的亲本链,新合成链由于没有甲基化位点而被保护。由于此法需要扩增质粒全长序列,因此在PCR反应中应特别注意扩增的保真性,一般采用高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。successfulusesofproteinengineeringforbioremediation运用DNA改组技术成功地获得了具有高降解效率的生物催化剂，主要用于降解含氯乙烯（三氯乙烯、二氯乙烯、反二氯乙烯）和多环芳烃（萘、菲、芴、蒽）。Cho等通过两轮的DNA改组和筛选，分离得到可提高降解甲基对硫磷的突变体,其中典型的突变体为22A11,水解甲基对硫磷的能力较野生型提高了25倍。Ang等对苯胺加双氧酶的Val205进行点饱和突变,获得的突变子Val205Ala能极有效地降解2-异丙基苯胺Hill等对磷酸三酯酶His254、His257和Leu303位点进行了点饱和突变,获得了降解有机三酯速率提高3个数量级的进化子,为解决有机磷污染提供了一个行之有效的途径Canada等通过对BurkholderiacepaciaG4来源的甲苯单加氧酶进行体外定向分子进化,以提高其对氯乙烯和萘氧化物的活性。经过体外分子进化,获得活性提高的突变酶。在大肠杆菌中表达突变的突变酶,其降解三氯乙烯、二氯乙烯速率明显加快。表达突变酶的整个细胞的合成1-萘酚速度比野生型的突变酶快6倍,而且突变酶其区域专一性没有改变。进一步研究发现,在大肠杆菌中表达的突变酶表现出对三环复合物菲、芴和蒽较野生型更快的氧化效率。Dai等使用基因改组提高了S.chlorophenolicum降解五氯苯酚的水解能力和对高浓度五氯苯酚的耐受力。Bosma等构建了一个能够在三氯丙烷培养基中生长的生物体。在亚甲基曙红兰的平板上选择对降解三氯丙烷活性提高的卤代烷脱卤酶,经过两轮体外定向进化,获得含有两个氨基酸位点的突变,Cys176Tyr和Tyr273Phe,表现出比野生型对三氯丙烷脱卤效率提高8倍的卤代烷脱卤酶。FamilyandgenomeshufflingforPCBsand

pentachlorophenol(多环芳烃和五氯酚)Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改组”的概念。他们发现,采用传统的DNA改组方法虽然能完成定向进化的目的,但其中随机产生的多为点突变,且有益突变频率低,导致筛选工作艰巨且进展缓慢。

DNA家族改组(DNAfamilyshuffling)是以来自不同种属的同源基因作为重排对象进行DNA改组操作的技术。该技术打破不同种、属间的遗传界限,利用同源基因之间的同源序列进行DNA改组,通过提高亲本基因群中差异的组合频率和改组子代的杂合度,以增加突变文库的多样性,提高突变文库的质量,进而有效地产生满足需要的突变体。与其他DNA改组技术相比,DNA家族改组技术不仅可以显著加速有益突变的累积,还易于实现目的蛋白多种特性的共进化。Kumamaru等对P.pseudoalcaligenesKF707的bphA1（联二苯双加氧酶）基因和Burkholderia

sp.strainLB400的bphA基因进行了体外分子进化改造,提高了菌株对多氯联苯的降解能力,还扩大了菌株的降解范围。经改组和筛选获得的bph突变基因在大肠杆菌细胞培养,对乙苯、丁苯和异丙苯降解能力较野生型高。successfulusesBarriault等针对联二苯双加氧酶基因的片段进行改组。其中联二苯双加氧酶的同源基因片段分别来源于Burkholderiasp.,Comamonastestosteroni和Rhodococcusgloberulus。研究者在较小的库容内筛选到的新酶不仅对2,2-二氯联苯、3,3-二氯联苯和4,4-二氯联苯活力提高,而且对不易分解的2,6-二氯联苯也具有良好的氧化能力。基因组改组重组几个菌株同源染色体可以提高整个生物体的活性。该方法已用于生物修复中五氯酚的降解，Dai等通过三轮基因组改组将Sphingobilumchlorophenolicum对剧毒杀虫剂五氯苯酚的耐受浓度提高了10倍以上,并可将培养基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。Vezina等借助DNA家族改组技术探索了苯双加氧酶BPDOs底物的立体专一性和结构之间的关系,获得了对2,2’-CB(2,2’-二氯联苯)中C5和C6的氧化活性提高的新酶S100、S149和S151。其中,S100还能催化2,2’-CB得到顺-5,6-二氧-5,6-二羟基-2,2’-二氯联苯,而且能降解一些其野生型双加氧酶所不能降解的苯、甲苯类单环芳香化合物,扩大了酶的底物范围。我国的Li等选取15种硝化细菌,对其硝酸氧还酶的同源基因进行家族改组后获得了生长速率加快的克隆(平均代时16h-18h),同时氧还酶的酶活提高10倍以上。Metabolicengineeringforchlorinatedaliphatics代谢工程(metabo1icengineering)又称途径工程,由著名生化工程专家BaileyJE于1991年首先提出,他将其定义为“采用重组DNA技术,操纵细胞的酶、运输及调节功能,达到提高或改善细胞活性的目的”,并论述了代谢工程的应用、潜力和设计。随着代谢工程研究应用的深入,现在将其定义为利用基因工程技术,有目的地对细胞代谢途径进行精确的修饰、改造或扩展、构建新的代谢途径,以改变微生物原有代谢特性,并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合,提高目的代谢产物活性或产量、或合成新的代谢产物的工程技术科学。代谢工程的一个重要应用领域就是构建能够降解有害物质的微生物。Lee等报道了杂交菌Pseudomonas可以同时聚集苯、甲苯、二甲苯而不积累其代谢中间体Suyama等构建的杂交Pseudomonas可以生长在碳氢培养基上并可以降解三氯乙烯。Jung等构建的菌株还能降解硝基苯类。这些都说明利用代谢工程构建新的菌株能高效的降解多种有机污染物。successfulusesArnold等利用山葵过氧化物酶(HRP)可以将苯酚或儿茶酚等具有羟基的芳香族化合物连接成可发出荧光的二聚体的原理而开发了一种高通量的荧光数字成像筛选方法,这种方法可以快速从DNA改组后得到的大量产物中筛选出活性得到提高的加氧酶(该酶催化芳香族化合物的羟基化反应)。Rojo等成功改造了Pseudomonassp.硝基苯酚降解菌B13：将三种不同细菌的五种不同的代谢途径重组于单个生物体进行甲酚和甲苯的降解。2-氯甲苯是一种较难降解的氯代芳香族化合物。Haro等对2-氯甲苯的代谢降解途径进行了深入的研究，并构建了可以降解2-氯甲苯的假单胞工程菌。Walker等将有机磷水解酶基因opd和来自Pseudomonas

sp.ENV2030的对硝基苯酚降解基因簇转入Pseudomonasputida中得到能以对硫磷作为唯一碳源和能源生长的工程菌，为该类污染物的降解提出了新的方法。Reichmuth等利用randomPCR对dszB的启动子进行随机突变获得不同的启动子突变体库，然后把启动子突变体克隆到绿色荧光蛋白基因（greenfluorescenceproteingene，gfp）的上游形成一个dszB-gfp操纵子，通过GFP（greenfluorescenceprotein）的强度的变化来筛选强的启动子，提高DszB的表达水平，得到了对二苯噻吩脱硫速率快的菌株。Richins等研究表明,表面展示有机磷水解酶(organophosphorushydrolase,OPH)的工程菌降解对硫磷和对氧磷(paraoxon)的速度是胞内表达OPH菌株的7倍,而且比纯化的OPH更稳定。Sicilian和Greer报道，接种假单孢菌Pseudomonassp.后，草地麦雀在含有41g/kgTNT（三硝基甲苯）土壤中的生长量比不接种处理增加了50%，而TNT的降解量也增加了30%，表明该菌株在增强草地麦雀对TNT污染适应性的同时，通过改变根际微生物种群结构而加速TNT的降解。代谢工程在混合污染处理中也得到成功的应用。例如，许多超级投资场所都被氯化物如TCE（三氯乙烯）和重金属污染，因此，有效解决这种混合污染的策略就是用能在重金属污染土壤中生长的、降解TCE的根际细菌。Shim等构建表面表达金属结合肽EC20、植物螯合肽(Glu-Cys)20的根际菌株，能积累金属和降解的TCE，使镉积聚提高6倍。当镉存在而菌株缺乏EC20表达时，TCE降解率降低，然而EC20的表达能完全修复TCE的降解。这些结果表明EC20的表达不仅积聚镉，还降低镉对细菌降解TCE的毒性影响。Wu等研究表明恶臭假单胞菌06909表达的EC20能积聚镉，降低镉对向日葵的毒性。MetabolicengineeringformixedwastesWhole-transcriptomeprofilingtofacilitate

rhizoremediation利用DNA微数列的Whole-transcriptomeprofiling的优势是：与蛋白质组学技术相比，更容易检测全部基因组的转录子相对量，蛋白组不能简便的辨别鉴定所有的蛋白质。然而，转录组学可以通过转录子的变化来预测蛋白质形成的变化，可能不是特别准确，但对于主要调控发生在转录水平的原核生物是很准确的。转录组即一个活细胞所能转录出来的所有mRNA。研究转录组的一个重要方法就是利用DNA芯片技术检测有机体基因组中基因的表达。从基因组DNA转录的基因总和，即转录组，也称味表达谱，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。而研究生物细胞中转录组的发生和变化规律的科学就称为转录组学(transcriptomics)。第一个根际细菌的转录学研究是鉴定了白杨树根致病绿脓假单胞菌的几个新的细菌毒力基因，并用这个转录本调查研究了植株对致病菌的全转录组响应答。在生物修复中，全转录组学还用来检测根际生物修复菌株的相互影响，如生长在玉米根部的恶臭假单胞菌的90个根际正调节基因被鉴定。Proteomicsinbioremediation尽管微阵列的分析能力很强大，转录组学研究平台只包括那些适应生长条件变化细胞的转录物。大多数细胞内和细胞间的生物化学过程都会受到蛋白质-蛋白质或者其他蛋白质-底物相互作用的影响。蛋白质组水平的基因表达分析提供了一个快速的可控制生物合成的快照过程，其中大部分是由转录组学平台调控的。同时，转录组本身通过表达的蛋白质或者是细胞生化状态下其他的变化，进行反馈控制。人类基因组计划被誉为20世纪的三大科技工程之一。其划时代的研究成果——人类基因组序列草图的完成，宣告了一个新的纪元——“后基因组时代”的到来。其中，功能基因组学（functionalgenomics）成为研究的重心，蛋白质组学（proteomics）则是其“中流砥柱”。正因为如此，Nature、Science分别在2001年2月15日、16日公布人类基因组草图的同时，分别发表了“Andnowfortheproteome”（Nature409：747，2001）、“Proteomicsingenomeland”(Science291：1221,2001)的述评与展望，将蛋白质组学的地位提到前所未有的高度，认为是功能基因组学这一前沿研究的战略制高点，蛋白质组学将成为新世纪最大战略资源——人类基因尤其是重要功能基因争夺战的重要“战场”。

双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。蛋白质组研究的技术路线如下图：样品细胞、组织、体液双向电泳电转印到膜上图象分析，数据处理胶上原位酶切直接1继续处理2继续处理3蛋白质组学研究技术路线Edman降解氨基酸分析N端序列氨基酸组成肽混合物MALDI/TOF/MS肽质量指纹谱数据库检索ESI/MS/MS肽序列标签PSD/MALDI/TOF/MS32蛋白质鉴定寡核苷酸合成蛋白实验免疫组化肽合成基因抗体蛋白活力蛋白定位蛋白质组数据库二维凝胶电泳分离技术

定义：二维电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离.

①等电聚焦：电荷②SDS凝胶电泳：分子大小常用的蛋白质组学技术

二维凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。2-DE是由O’Farrell和Klose

于1975年分别提出的，在2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离，接着被转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离。由于电泳装置的限制和载体两性电解质的特性，使得2-DE的重复性很差，很难制备大量重复性好的2-DE胶。20世纪80年代初期出现的固相化pH梯度(immobilizedpHgradient，IPG)等电聚焦电泳技术．使2-DE的重复性和上样量大大改善，不同实验室之间的实验结果可以进行比较，加之后续的微量鉴定技术如Edman微量测序技术以及质谱技术灵敏度的提高，使得2-DE获得了广泛的应用，成为蛋白质组研究中首选的分离技术。尽管如此，2-DE技术仍存在许多不足，如膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测、重复性以及规模化和自动化的问题。

Silverstained2-Dgelsfromtissuesamplesofrabbithearts.

生物质谱技术1、发展历程七十年代初用于小分子分析鉴定的电离技术，如：电子轰击(Electronimpact,EI)电离和化学电离(Chemicalionization,CI)技术等。质量分析器主要为磁场分析器(magneticSector)。七十年代末、八十年代初出现了场解吸(Fielddesorption,FD)、场电离(Fieldionization,FI)和快原子轰击(Fast-atombombardment,FAB)技术。质量分析器主要为磁场分析器(sector)、四极杆滤波器(quadrupole,Q)和离子回旋共振(ioncyclotronresonance,ICR)分析器。近十几年出现了电喷雾电离(Electrosprayionization,ESI)技术、基质辅助激光解吸电离(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization,MALDI)技术和表面增强激光解吸电离(Surface-enhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)技术等.质量分析器为磁场分析器(sector)、四极杆滤波器(quadrupole,Q)、离子阱分析器(Iontrap)、离子回旋共振(ioncyclotronresonance,ICR)分析器和飞行时间分析器(Time-of-flight,ToF)。2、主要质谱仪

目前商业化的生物质谱仪，其离子化方式主要是电喷雾电离与基质辅助激光解吸电离，前者常采用四极杆质量飞行器，所构成的仪器称为电喷雾(四极杆)质谱仪，后者常采用飞行时间质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。电喷雾质谱的特点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用，因而可实现复杂化合物分离与鉴定的联机操作。而MALDI-TOF质谱仪的特点是对盐和填加物的耐受能力强，且操作简便，测定速度快，易于实现高通量，谱峰与样品成分的质量有一一对应关系，图谱容易解析。此外，用于生物大分子测定的质谱仪还有离子阱(iontrap)