体内药物分析课件

第四章

体内药物分析

方法的建立与验证4/8/20231体内药物分析分析方法的设计依据分析方法建立的一般步骤分析方法验证的内容与要求体内药物分析应用示例本章内容提要第四章分析方法的建立与验证4/8/20232体内药物分析第一节

分析方法的设计依据建立分析检测方法的主要依据待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况分析测定的目的与要求生物样品的类型与预处理方法实验室条件第四章分析方法的建立与验证4/8/20233体内药物分析(一)待测药物的理化性质 药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法 具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等 具有挥发性——GC测定法 具有光谱或电化学特性——分析检测方法 药物的稳定性——萃取浓缩技术 对酸碱不稳定——避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定——避免高温蒸发溶剂第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/8/20235体内药物分析(二)待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低 ——分离萃取方法

蛋白结合较强——不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物 ——分析检测技术

浓度较低（尤其有代谢产物共存） ——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 ——采用LC-MS、EIA等分析检测技术第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/8/20236体内药物分析二、分析测定的目的与要求

体内药物分析的目的——影响分析方法的应用

药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物

要求 ——同时测定原形药物和代谢产物

检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属 性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)

方法 ——不必强调方法的简便、快速； ——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/8/20237体内药物分析三、生物样品的类型与预处理方法

生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用

以血浆或血清为分析样品

采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测

用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/8/20239体内药物分析四、实验室条件 在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据4/8/202310体内药物分析第二节分析方法

建立的一般步骤一、分析方法的选择二、分析方法的建立 (一)

检测条件的筛选 (二)分离条件的筛选第四章分析方法的建立与验证4/8/202311体内药物分析二、分析方法的建立分析方法建立之前 查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法 ——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/8/202313体内药物分析二、分析方法的建立初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件

同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述分析方法的建立步骤第一步：检测条件的筛选第二步：分离条件的筛选第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/8/202314体内药物分析(一)检测条件的筛选

标准物质

——照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定

——确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度

HPLC——调整检测器(类型、条件)

色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)

流动相(组分及其配比)及其流速

柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等

——使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)

良好的色谱参数(n、R、T)

适当的保留时间(tR)第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/8/202315体内药物分析1．空白溶剂试验

待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液） ——采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等） ——测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）

考察目标

——方法的特异性

——空白值应尽可能小，并能有效校正第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/8/202317体内药物分析色谱分析法

——可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型 ——空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R＞1.5）

本步骤主要考察 ——需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验

第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/8/202318体内药物分析2.空白生物基质试验

空白生物基质(blankbiologicalmatrix) ——如空白血浆 ——照“1.空白溶剂试验”项下方法操作

考察目标 ——生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性） ——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/8/202319体内药物分析色谱分析法 ——进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的分离情况 ——色谱峰的

tR、n

和T

是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分 标准曲线的截距是否显著偏离零点等 ——内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/8/202321体内药物分析4.实际生物样品的测试

空白生物基质和模拟生物样品试验——确定的分析方法及其条件 ——不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定 ——药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物) 或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)

实际生物样品——确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试

考察目标 ——代谢产物对药物、内标物质的干扰情况 ——进一步验证方法的可行性第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤4/8/202322体内药物分析第三节分析方法

验证的内容与要求 用于实际生物样品分析之前 ——验证(validation)分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法 ——所有可变因素(采样,样品制备,色谱分离,检测与数据评价等) 使用的技术指标 ——效能指标 使用的样品

——通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品第四章分析方法的建立与验证4/8/202323体内药物分析验证的效能指标与基本要求 1．特异性——避免干扰 2．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围 3．准确度——与实际状况相符 4．精密度——结果可重现 5．定量限——达到峰浓度的1/10～1/20 6．稳定性——确保所有样品准确测定 7．提取回收率——确保准确度第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202325体内药物分析一、方法特异性(专属性或选择性)

方法的特异性(specificity) ——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用 ——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力 专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力

特异性——函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202326体内药物分析3.伍用药物的干扰

TDM时 ——还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰

比较——待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 ——如HPLC色谱峰的tR、n

和T是否一致

确证——同时服用药物对分析方法的干扰情况第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202329体内药物分析4.与参比方法的相关性

除上述方法外，有时还可使用参比方法对照

参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法 ——如在TDM中使用UV(或RIA)时,可以HPLC(或GC)为参比

参比方法测定结果为横坐标(X);拟定方法结果为纵坐标(Y) 用最小二乘法计算回归方程Y＝a＋bX

(坐标标度相等)

相关系数(r)——表示两种方法测得结果的一致性 ——若

r≠1，表示拟定方法为非线性，如RIA中抗血清滴度选择不当第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202330体内药物分析4.与参比方法的相关性

Y＝a＋bX

截距(a)——表示拟定方法受到恒定干扰的程度——内源性物质(UV)

斜率(b)——表示拟定方法受到比例干扰的程度——标记抗原不纯(RIA)

与参比方法的相关性比较——除显示分析方法的特异性外 ——斜率b表示两种方法测得结果的一致性

若参比方法准确度良好

——若截距a≈0,则拟定方法的准确度(回收率)为100b(%)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202331体内药物分析二、标准曲线与线性范围

标准曲线（standardcurve）——calibrationcurveorworkingcurve ——生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度） ——通常用回归分析方法所得的回归方程来评价 ——除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式 ——回归分析法为最小二乘法（leastsquares） 或加权最小二乘法（weightedleastsquares）

线性范围（linearrang）——标准曲线的最高与最低浓度的区间 ——模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202332体内药物分析二、标准曲线与线性范围(续) 标准曲线——用模拟生物样品建立 ——线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度 ——不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度

建立标准曲线所使用的模拟生物样品 ——应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202333体内药物分析标准曲线的一般建立方法

1.标准系列溶液(非生物基质溶液)的制备 溶剂——水或甲醇（或其他适当溶剂） 浓度——标准模拟生物样品中药物浓度的50倍以上 加入量为生物样品总体积的2%以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异

浓度较低——应除去溶剂后再加入生物基质 否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202334体内药物分析2.标准系列溶液的浓度范围 至少含5～8个浓度点(不包括零点,即空白) ——可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常数约为2) 若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5 设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异)

实际制备时：500、250、100、50、20、10……第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202335体内药物分析3.标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质(如血浆)——加入标准系列溶液适量，涡旋混匀

为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失 ——①先加入标准溶液③ ②再加入空白生物基质 ③涡旋混匀①②第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202336体内药物分析4.标准曲线的绘制 以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高)或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量,y)对模拟血药浓度(自变量,x) ——求得回归方程(y＝a＋bx)及其相关系数() 在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的标准曲线中，至多可有2个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如： ——样品处理有损失、色谱图有问题，或 ——显著偏离标准曲线〔该数据参与标准曲线回归后，计算QC样品或返算该点浓度时显著偏离其标称浓度(配制浓度)〕 ——其余应有至少5个浓度点在标准曲线上第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202337体内药物分析5.加权最小二乘法

最小二乘法——每个浓度点绝对误差(yi－yi’)赋予同等的重要性

标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达102) ——低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求

加权最小二乘法——回归计算时增加一个权重因子(w) ——各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小 式中，wi为标准曲线上第i个浓度点的权重因子第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202338体内药物分析1）回归方程(y=a+bx)参数的计算

第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202339体内药物分析2）权重因子的选择

加权——赋予低浓度点以更大的权重

在实际工作中的一般方法 ——当wi=1/(yi’)2时，则 ——而yi与xi成正比 ——所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2(通常取wi=1/C2)

当高浓度点测量值的准确度下降过大 ——低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，wi=k/xi第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202340体内药物分析标准曲线的限度要求 药代动力学或生物利用度研究 ——标准曲线至少包括5个浓度(通常为5～8个浓度,不包括零点)

——最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%～5%，并应为方法的LOQ(非LOD) ——回归方程的截距应接近于零 ——相关系数要求≥0.99(色谱法)或≥0.98(生物学方法) ——若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归——如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202341体内药物分析三、准确度 方法准确度(accuracy) ——系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度 ——应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定 ——一般用相对回收率(relativerecovery，RR)或相对误差(relativeerror，RE)表示第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202342体内药物分析1.测定法 取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算 在标准曲线范围内制备质控(qualitycontrol，QC)样品 ——高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3个浓度 ——每一浓度至少5个样本 ——与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202343体内药物分析2.结果计算与限度要求

计算 ——测定值M(measured)平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值 相对回收率 相对误差 限度要求 ——相对回收率应在85%～115%(LOQ附近80%～120%) ——RE在±15%(LOQ附近为±20%)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202344体内药物分析四、精密度 方法精密度(precision) ——系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度 ——表示该分析方法的可重复性(reproducibility) ——反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一 实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.5～2ml) ——使用模拟生物样品测定第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202345体内药物分析1.表示方法 方法精密度一般用标准偏差(standarddeviation，SD)或相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示 SD= RSD= = ——包括批内(within-run或intra-assay)RSD—日内(within-day)

和批间(between-run或inter-assay)RSD—日间(between-day，day-to-day)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202346体内药物分析2.测定法——分别测定法(Ⅰ) 照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低3个浓度的QC样品，并分析测定

批内RSD ——每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD

批间RSD ——每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度5～6个分析批数据)的RSD第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202347体内药物分析2.测定法——连续测定法(Ⅱ) 若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的每1批次为5～6个样本)——方差分析法

批间RSD= 批内RSD= =第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202348体内药物分析3.限度要求 在药代动力学和生物利用度研究中 对g/ml级水平的RSD一般应≤10% ng/ml级水平的RSD一般应≤15% 在LOQ附近RSD应≤20%。第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202349体内药物分析五、定量限 方法定量限(limitofquantitation，LOQ) ——系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度 ——又称为方法灵敏度(sensitivity) ——标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)

要求

——应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度 ——准确度在80%～120%(或RE在±20%的范围内) ——RSD＜20%第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202350体内药物分析六、稳定性与质量控制 稳定性——包括方法稳定性和样品稳定性

方法稳定性——方法的耐用性

样品稳定性——生物样品的存放条件和时间、冻-融循环

测定法——QC样品穿插于实际样品测定全过程 ——模拟(或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察

要求 ——准确度85%～115%(RE在±15%范围内)，RSD＜15%第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202351体内药物分析七、萃取回收率 生物样品的预处理方法 ——重点考虑方法准确度(或相对回收率)，操作简便、快速 ——萃取回收率(绝对回收率，absoluterecovery)，≥70% 萃取回收率与相对回收率的意义不同 萃取回收率——考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失 相对回收率——采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202352体内药物分析1.测定法 取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次 另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定

AT——经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法) AS——未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202353体内药物分析2.限度要求 萃取回收率一般应≥50% 高、中浓度的RSD应≤15% 低浓度的RSD应≤20%。第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202354体内药物分析第四节体内药物分析方法

应用示例 第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究

一、文献调研 性质——在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。第四章分析方法的建立与验证4/8/202355体内药物分析药动学参数

吸收过程——空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%～70%

Cmax——口服500mg后平均Cmax为2.4～2.6mg/L

Tmax——1～2h

T1/2——血中T1/2约为4h，肾功能减退时稍有延长至6h

蛋白结合率——20%～40%

代谢 ——口服给药24h内，40%～50%原形、15%代谢物经肾排出第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202356体内药物分析体内分析方法

RP-HPLC 色谱柱——ODS色谱柱 流动相——甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸)缓冲液(三乙胺调节pH2.3～3.5)，或离子对色谱:溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵) 检测——紫外或荧光检测

生物样品预处理 蛋白沉淀法——甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样 溶剂萃取法——二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂 蛋白沉淀-溶剂萃取——乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202357体内药物分析二、分析方法设计 1．分析方法 血浆蛋白结合率低(20%～40%)、以原形从肾排泄 生物等效性研究——测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间曲线。初步拟定：采用RP-HPLC法

2．检测方法 紫外——灵敏度＜1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上，当Cmax在2g/ml以上(口服500mg)时基本可满足生物等效性研究要求 荧光——灵敏度＜0.1ng，能满足本试验要求第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202358体内药物分析二、分析方法设计（续） 3．样品制备方法 初步拟定——采用简便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样分析 预试——含75%乙腈的提取液100l进样后，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿峰)，进而导致检测灵敏度降低(峰高降低) 经进一步试验，确定为： 血浆0.5ml→乙腈1ml沉淀蛋白→二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取→60℃氮气流吹干→流动相200l溶解→20l进样 灵敏度可达2ng/ml(血浆浓度)，符合要求(Cmax＞2g/ml)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202359体内药物分析三、实验方案 1．给药方案 20名受试者随机分为两组，每组10人 第1次试验——第一组口服受试制剂(相当于环丙沙星500mg)，第二组口服相同剂量的参比制剂 第2次试验——第1次服药后第7天开始，两组交换给药第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202360体内药物分析三、实验方案（续） 2．血样的采集与处理 分别口服给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(5~7个t1/2)小时 由肘正中静脉取血4ml 立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟(3000rpm)，分离血浆 -20℃冰箱中保存待测第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202361体内药物分析三、实验方案（续） 3．血样分析法 色谱条件 ——高效液相色谱仪(包括LC-10ATvp泵，RF-530荧光检测器)；色谱柱为KromasilODS-AP(200mm×4.6mm，5m) ——流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min ——检测波长为ex=277nm，em=445nm ——柱温为40℃。第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202362体内药物分析三、实验方案（续） 3．血样分析法 血浆样品的预处理 取血浆0.5ml，加内标溶液(10g/ml诺氟沙星甲醇溶液）50l、乙腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙醇(95:5)混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸取下层有机相，60℃下氮气流吹干，残渣加流动相200l，涡旋溶解30s，离心5min，取上清液20l进样第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202363体内药物分析四、分析方法验证 1．方法特异性 环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟沙星(内标物质)tR=10.9min，各峰均获得完全分离，内源性物质峰(与空白血浆样品一致)tR=8.6min对测定无干扰 志愿者用药后的血浆样品色谱图中环丙沙星与内标物质峰与模拟血浆样品中环丙沙星与内标物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不认为代谢物有干扰第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202364体内药物分析四、分析方法验证(续) 2．标准曲线 标准系列溶液——取盐酸环丙沙星，加水制成1、2、5、10、20和50g/ml的标准系列溶液，冰箱保存 标准系列模拟血浆样品——取空白血浆0.5ml，加环丙沙星标准系列溶液各50l，配制成相当于浓度为0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、5.0g/ml的QC样品，冰冻(-20℃) 测定法——取QC样品，照“血浆样品的预处理”项下方法操作，以环丙沙星浓度C为横坐标，环丙沙星与内标物质的峰面积比值Y为纵坐标，用加权最小二乘法经Excel运算，求得的直线回归方程为：Y=1.33·C-0.02583，R2=0.9951(C=0.1～5.0g/ml)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求4/8/202365体内药物分析四、分析方法验证(续) 3．方法精密度与准确度 QC样品——浓度为0.1、0.5和2.0g/ml 分析批次——3批，每批5样品 测得浓度——0.0988、0.4537和2.128g/ml

准确度

RE(%)——-1.2%、-9.3%和6.4%

精密度 批内(%)——6.7%、4.6%和3.9% 批间(%)——8.9%、9.6%和12.3%第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.34/8/202366体内药物分析四、分析方法验证(续) 4．方法定量限 受试制剂和参比制剂的Cmax分别为 ——3.2020.496和3.3000.730g/ml

方法的LOQ为0.1g/ml＜0.16

g/ml(Cmax的1/20) ——准确度和精密度均符合要求：RE为-1.2% 日内RSD为6.7%

日间RSD为8.9%第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.34/8/202367体内药物分析四、分析方法验证(续)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3血浆冰冻血浆冻融残渣冷藏室温放置时间（d）As/Ai循环（次）As/Ai时间（d）As/Ai时间（h）As/Ai02.728604.359502.989203.4263102.911314.490212.978183.4350202.781924.313923.0595243.43515．样品稳定性4/8/202368体内药物分析四、分析方法验证(续) 6．提取回收率

取空白血浆0.5ml，按“标准曲线”项下