植物蛋白质组学课件

第一篇分子与细胞生物学基础

第三章植物蛋白质组学

目录

1.蛋白质组和蛋白质组学

2.蛋白质组和基因组

3.植物蛋白质组的研究方法

3.1蛋白质双向电泳

3.2氨基酸序列测定

3.3质谱

3.4生物信息学

4.植物蛋白质组学的研究进展

4.1植物发育蛋白质组学的研究

4.2植物环境蛋白质组学的研究

4.3磷酸化蛋白质组学的研究

5.植物蛋白质组学研究的前景和挑战

5.1表达的整体分析以及蛋白质组编目

5.2大规模的蛋白质功能研究

5.3建立完整的蛋白质调控网络

1.蛋白质组和蛋白质组学蛋白质组：由一个基因组所表达的所有蛋白质。蛋白质组学：研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组所表达的全部蛋白质。它不是按照传统的方式孤立地研究某种蛋白质分子的功能,而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。

蛋白质组学分为表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。前者利用各种先进技术研究蛋白质表达的整体变化,即研究在机体的生长发育、疾病和死亡的不同阶段中,细胞与组织的蛋白质组分的变化;后者主要通过分离蛋白质复合物系统地研究蛋白质间的相互作用

（2）基因组的组成是固定的，蛋白质组的组成是动态的。基因组在所有细胞中几乎都是相同的，与之不同，蛋白质组具有很高的细胞和组织特异性。基因组是相对稳定的，蛋白质组处于高度动态变化之中。（3）细胞内蛋白质的拷贝数（108）远比基因拷贝数大（105）。（4）基因可采用PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有这些技术。

3.1蛋白质双向电泳

3.2氨基酸序列测定

3.3质谱技术

3.4生物信息学3.植物蛋白质组的研究方法蛋白质组研究的技术路线流程图3.1.1利用双向电泳研究植物蛋白质组的基本流程

蛋白样品提取→双向电泳分离蛋白→蛋白质染色→双向电泳图谱分析

→蛋白点切割→蛋白酶解和鉴定

该流程最关键的步骤是蛋白质样品的提取，它关系到下游蛋白质的分离和鉴定是否能够成功。好的蛋白质样品要求从某一个细胞、组织或器官中提取尽可能多的蛋白质，以最大限度地反应这个蛋白质组的全貌。3.1.2双向电泳的缺陷和解决方法

解决方法：

1.对样品进行前期分级

2.对不同的细胞器官或组织进行分离

3.使用宽胶条，符合重叠窄IPG凝胶

4.双向荧光差异凝胶电泳

5.多块胶垂直二维SDS系统

6.双向电泳工作站缺陷分辨率低重复性差耗时、自动化程度低蛋白质定量困难

通过使用不同强度的离液剂和表面去垢剂，并进行分步溶解分离，可以获得更多的蛋白质，同时降低蛋白质样品的复杂性，提高2-DE的分辨率。如：ReadyPrep顺序抽提试剂盒。

ReadyPrep试剂盒所需样品量较少，不需要额外的设备，是一种既节省时间又节省设备的好方法。

ReadyPrep

产品线包含一系列2-DE样品制备试剂盒，不仅适用于通用样品（总蛋白）处理，而且可以将复杂样品按特定方法分级。处理通用样品的试剂盒包括总蛋白抽提和蛋白净化（clean-up）。样品分级试剂盒可用来降低样品复杂程度，同时有助于低丰度蛋白的富集和鉴定。这类试剂盒又分为两种，一种是基于蛋白不同的亚细胞定位来分离，另一种是对细胞总蛋白进行分级。下面的流程图将帮您确定哪种试剂盒对您更适合。

一.对样品进行前期分级

顺序抽提试剂盒可将样品分离成3个递增溶解度组份。这3个分离份依次分离，使我们能观察到其它方法观察不到的蛋白。通过对每一分离份逐级使用更强的去垢剂，可提供递增的溶解度.

试剂一试剂二试剂三

二、对不同的细胞或组织进行分离

通过亚细胞分类，比如单独提取细胞壁、细胞核、细胞膜、线粒体和叶绿体等的蛋白质组分。优点：降低蛋白质样品的复杂性，提高分辨率，了解蛋白质的定位。

三、使用宽胶条，符合重叠窄IPG凝胶

2-DE的分辨率通常认为与有效的分离面积成正比，使用宽分离距离的IPG胶和长距离的二维SDS可以提高2-DE的分辨率。选用不同pH范围的胶条，通过重叠几次窄范围的IPG凝胶电泳结果，可以提高在某一区段尤其是蛋白质集中区段内的分辨率

pH范围3—104—75.0—6.0上样量40ug80ug120ug3.2氨基酸序列测定

氨基酸测序主要使用的是N端测序Edman化学降解法。降解反应分三步进行：第一步：偶联反应，降解试剂（PITC）与多肽链的游离氨基作用，形成PCT-肽。第二步：环化断裂反应，PCT-肽在无水强酸介质如三氟乙酸中，最靠近PTC基的肽键将发生断裂，同时PTC-氨基酸残基环化成ATZ衍生物。第三步：转化反应，首先水解生成PTC-氨基酸，然后环化成PTH-氨基酸，其在紫外区有很强的吸收峰。它可以被各种技术层析出来，然后鉴定。每轮Edman反应，可以鉴定一个氨基酸，剩下的减少一个残基的肽链便在它的N端暴露一个新的氨基，又可参与第二轮反应。偶联反应环化断裂反应转化反应3.3质谱质谱仪离心源质量分析器离子检测器基质辅助激光解吸电离（MALDI）电喷雾电离（ESI）飞行时间（TOF）四级杆（Q）离子阱（IT）常用的质谱仪有：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IT-MS傅里叶变换离子回旋共振么质朴（FTMS）TypicalresultfromMALDI-TOFPeptidefingerprinting(PMF)withMALDI-TOF

trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:??isidenticalto??massspectrometrystoreddataortheoretical?peptides各种质谱仪的适用范围：MALDI-TOF-MS：分析鉴定一些相对比较简单的多肽混合物和进行高通量蛋白质组的研究。ESI-MS：分析复杂的蛋白质样品，鉴定组成蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的翻译后修饰。FTMS：鉴定氨基酸的序列和分析蛋白质修饰。Bottom-up蛋白质组学：需要将蛋白质样品进行蛋白酶水解。如：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IF-MSTop-down蛋白质组学：可以直接分析完整的蛋白质样品，不需要经过2-DE的前处理。如：FTMS4.植物蛋白质组的研究进展4.1发育蛋白质组学的研究

发育蛋白质组：指植物在某一特定的生长发育时期，在特定的生长条件下，特定的细胞、组织或器官中所表达的所有蛋白质。

发育蛋白质组学：它揭示了在每一个特定时期所表达的蛋白质和这些蛋白质在特殊的生长时期可能发挥的作用，是进一步了解和深入研究蛋白质功能的基础。双子叶植物：开展了根、茎、叶、花、种子和果实的蛋白质组学组研究课题。单子叶植物：增加了叶鞘、花药、胚、胚乳等蛋白质组的研究课题细胞器：细胞壁、内质网、细胞膜、叶绿体、线粒体等4.2植物环境蛋白质组学的研究

4.3磷酸化蛋白质组学的研究

环境因素非生物因素：厌氧、冷、热、干旱、盐、重金属等生物逆境：植物真菌、病毒植物激素：生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯等

研究与环境因素相关的蛋白质，观察它们在逆境环境条件下表达量的变化，并研究它们是如何抵抗外界不利的生长环境，维持细胞的生命活动环境蛋白质组学：

谢谢

基因组(DNA)

转录组(RNA)蛋白质组(PROTEIN)CitrateCycle代谢组(biochemicalmolecular)蛋白质组学解决的问题细胞中蛋白质的含量蛋白质活性蛋白质的修饰蛋白质之间的相互关系蛋白质的定位实例植物组织2-DE分析pH3

pH10100KD10KD物种：水稻组织名称：根部制备方法：液氮研磨+TCA-丙酮沉淀法上样量：500μg电泳种类：pH值3-10NL，13cm，12.5%染色方法：胶体考马斯亮蓝染色法IPG←常见显色方法比较显色方法灵敏度优点缺点考染200ng操作简便，价格低廉，便于后续鉴定灵敏性差，所需上样量大银染0.1ng灵敏性好，所需样品少操作复杂，不利于后续鉴定荧光法1ng线性动态范围大，定量及定性较好，便于后续鉴定仪器及试剂昂贵消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其PI值处的溶解性兼性离子型去污剂：CHAPS，浓度2-4%；SB3-10、ASB-14

非离子型去污剂：NP-40和Triton-X-100

阴离子型去污剂：S