微生物第八章 4课件

第四节基因重组与遗传育种8.4.1基因重组8.4.2细菌的转化8.4.3细菌的转导8.4.4细菌的接合8.4.5基于基因重组的遗传育种方式8.4.1基因重组两个DNA分子之间发生分子水平上的重新组合，产生具有不同核苷酸序列的新的DNA分子，这一过程叫做基因重组；位点专一性重组同源重组转座重组不正常重组同源序列：碱基序列相似的两段DNA序列；同源重组：两个具有同源序列的DNA之间发生相互性或非相互性交换重组；同源重组过程：DNA解链、单链断裂、配对、重接形成异源双链区，然后经DNA复制而纯化；配对重接断裂异源双链解链断裂同源重组的过程原核生物的基因重组原核生物缺乏有性繁殖，基因重组并不普遍存在，相对频繁的基因突变，是基因多样性的来源；原核生物中存在几种特殊的基因水平转移方式：转化、转导、接合；在一定条件下，这几种基因水平转移方式，能够导致原核生物之间发生基因重组；通过上述方式发生基因重组，而形成的具有新的基因型的细胞，称为重组子；8.4.2细菌的转化感受态细胞（competencecell）：某些微生物在特定环境条件下出现的，能够将胞外DNA片段吸收进入细胞的一种特殊生理状态；肺炎双球菌、芽孢杆菌、假单胞菌、大肠杆菌等细菌具有感受态；真核的酿酒酵母等能够形成感受态；转化（transformation）：感受态细胞吸收外源DNA进入细胞，而发生基因重组的过程；通过转化而形成的重组子，也称为转化子（transformant）；自然感受态的形成机制细胞在生长过程中不断释放感受态因子，其浓度随细胞密度的增加而增加；高浓度的感受态因子作用于细胞膜上的受体蛋白，传递细胞浓度信号，导致自溶素基因表达；产生的自溶素激活细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶，使细胞处于感受态；转化和转化子的形成感受态细胞吸收的外源DNA，如果与自身染色体具有同源性，就有一定的几率发生同源重组，产生杂合的DNA区域；当DNA复制时，产生纯合的新型子代DNA；细胞分裂时，新型子代DNA进入子细胞，形成的具有新的基因型的转化子；转染（transfection）和广义的转化用提纯的噬菌体DNA，通过转化的方式转入宿主细胞，结果产生完整的子代病毒颗粒，称为转染；广义的转化：将游离DNA片段或质粒转入受体细胞的技术手段，是基因工程的基本方法之一：人工感受态转化原生质体转化电转化：击穿细胞壁和细胞膜8.4.3细菌的转导转导（transduction）：通过转导噬菌体，借助噬菌体的感染能力，将外源DNA导入受体细胞，而发生基因重组的方式；转导噬菌体：噬菌体衣壳内全部为外源DNA的完全缺陷型噬菌体，或者衣壳内带有部分外源DNA的部分缺陷型噬菌体；部分缺陷型噬菌体的形成整合在溶源化细胞染色体上的原噬菌体，去整合化时可能发生“误切”，自身部分DNA与旁侧的染色体发生了交换而切割下来，形成部分缺陷的噬菌体核酸；部分缺陷的噬菌体核酸仍然能够正常复制和基因表达，并装配、裂解宿主细胞，产生部分缺陷型的子代噬菌体；几率低于10-6；完全普遍性转导完全缺陷型噬菌体感染另外的宿主细胞，而将来自供体菌的一段外源DNA转入受体菌；如果外源DNA与宿主染色体发生了基因重组，则形成具有新基因型的重组子，叫做转导子（transductant），这种基因重组形成重组子的方式，称为完全转导；由于完全缺陷型噬菌体能将供体菌的任何一段DNA转入受体菌，由此而发生基因重组，形成重组子的方式，也称完全普遍性转导；普遍性转导的其它结果如果由完全缺陷型噬菌体转入的供体菌DNA片段，没有发生基因重组，而被受体菌降解，则称为为转导失败；如果转入的DNA片段不能与宿主染色体发生基因重组，也没有被降解，而是存在于受体菌中，称为流产转导；低频转导在溶源菌的诱发裂解物中，部分缺陷型噬菌体的含量极低（低于10-9），称为低频转导裂解物；用这种低频转导裂解物，在低感染复数下进行转导，只能得到极少量的转导子，称为低频转导；感染复数（m.o.i）：用噬菌体感染宿主时，所用噬菌体的数量与宿主细胞数量的比值；高频转导用高感染复数的低频转导裂解物感染受体菌，可能分离出既被正常噬菌体感染，同时又被部分缺陷型噬菌体感染的双重溶源化细胞；诱发裂解双重溶源化细胞，正常噬菌体与部分缺陷型噬菌体同样增殖，形成部分缺陷噬菌体含量占50％的高频转导裂解物；用高频转导裂解物感染受体菌，能够高频率的得到转导子，为高频转导；8.4.4细菌的接合“雄性”（F+）菌株：指带有转移质粒（F质粒）的大肠杆菌菌株，长有几根性菌毛；“雌性”（F-）菌株：不带转移质粒，没有性菌毛的大肠杆菌株；接合（conjugation）：F+与F-菌株通过中空的性菌毛连接，并将F质粒的拷贝转移给F-菌株，使F-也变成F+菌株的生理过程；中断杂交在自然条件下，DNA转移过程受环境因素干扰，随时可能终止，完整的转移需要100分钟，常出现不同转移时间的中断杂交；中断杂交使Hfr菌株的部分染色体转移到F－中；接合子的产生Hfr菌株与F-菌株接合能够高频率的将供体菌的部分DNA转移到受体菌中；同时，供体DNA与受体菌DNA之间同源性很高，能够高频率的发生基因重组，产生具有新基因型的接合子；

F′质粒的性导F质粒从染色体上切离时，可能发生“误切”，形成带有一段宿主DNA的质粒，叫做初生F′质粒；初生F′菌株仍具有F+菌株的所有表型，与F－接合后，初生F′质粒转移到F-菌株中，形成带有次生F′质粒的F′菌株；次生F′质粒带有的供体菌DNA，如果与受体菌染色体发生基因重组，则产生重组子，这种基因重组方式称为F质粒转导，或性导；菌种的衰退与复壮菌种的衰退：对于产量突变型而言，由于自发突变，以及培养条件的选择作用，使得回复突变株逐渐积累，当达到一定数量时，菌种的产量性状开始下降；菌种的复壮：从已出现衰退的细胞群体中，把未发生回复突变的原种分离出来，恢复原种的典型性状；防止衰退的措施：采用使细胞彻底休眠的长期菌种保藏方法，减少自发突变几率；短期保藏的菌种，在使用中要尽量减少传代次数，并定期进行纯种分离；

菌种的保藏菌种保藏目的：使微生物菌种短期或长期存活，不因衰老而死亡、不因突变而变异、不因染菌而混杂；菌种保藏的原理：在不损伤细胞的前提下，使细胞或孢子因缺乏一种或多种必要的生长（萌发）条件而处于缓慢代谢的半休眠或彻底休眠的状态：缺乏或无营养、低温（低于最低生长温度）、超低温、隔绝空气（无氧）、干燥（水活度远低于生长要求）；菌种长期保藏法超低温保藏法：用于营养细胞保藏；细胞悬液加保护剂，置-70℃～-80℃（超低温冰箱）或-196℃（液氮罐）保藏数年；冷冻真空干燥保藏法：用于营养细胞保藏；细胞悬液加保护剂，速冻，真空干燥脱水，细胞干粉密封在安瓿管，于4℃~-20℃（普通冰箱）保藏数年；沙土管干燥保藏法：用于孢子保藏；孢子悬液与细砂土颗粒混合，充分干燥后密封于安瓿管，保藏数年；国际著名微生物菌种保藏机构ATCC：美国典型培养物保藏中心NR