微生物教程yyd第八章微生物的遗传变异和育种课件

第八章微生物的遗传变异和育种第一节遗传变异的物质基础第二节基因突变和诱变育种第三节基因重组第四节基因工程第五节菌种的衰退、复壮和保藏

第一节遗传变异的物质基础

一、三个经典实验

（一）经典转化试验

F．Griffith（1928年）

肺炎双球菌，可使人患肺炎，也可使小白鼠患败血症而死亡。它有多种菌株，其中具有荚膜，且菌落表面光滑（smoth）的致病菌株,称S型;另一种不形成荚膜,菌落粗糙（rough）,无致病性,称R型。F．Griffith作了3组实验如下图

后来，有三位科学家将第三组实验进行如下改进：从高温灭活的S型细菌中提取几种细胞成分(如DNA、蛋白质、荚膜多糖等)分别进行转化实验——Avery实验，如图示：

以上实验说明：高温灭活的S型肺炎球菌的细胞内存在一种物质，能以某种方式进入R型细胞使其表达出荚膜性状。其中Avery实验进一步证明转化因子是DNA。噬菌体感染实验Pr只含S不含PDNA只含P不含S原理步骤1：用含同位素Ｓ35,

P32的培养基培养大肠杆菌2：让T2感染上述大肠杆菌使其打是S35P32标记3：吸附10分钟后搅动离心上清液沉淀结果：上清液中含15%放射击性；沉淀中含85%放射性（三）植物病毒的重建试验

烟草花叶病毒（TMV）是一种只含RNA的植物病毒，其中94%是蛋白质外壳，6%是RNA。可在烟草上引起病斑。把TMV放在水和苯酚中震荡，可将病毒的蛋白质外壳和RNA分开，分开的蛋白质外壳和RNA分子又能重新组合成具有感染力的完整病毒粒子。另一株与TMV近缘的霍氏车前花叶病毒（HRV），也可引起病斑。但两种病斑的表征不同。1956年，Fraenkel-conrat利用这两株植物病毒的核酸和蛋白质的拆、合及相互对换进行实验如下图。植物病毒的重建实验TMVHRVHRVTMV原始株拆开重建感染分离纯化

（一）七个水平细胞水平细胞核水平染色体水平核酸水平基因水平密码子水平核苷酸水平二、遗传物质存在的部位和方式质粒：凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子。质粒特点：从结构上看为超螺旋结构从大小上看，相对分子质量为106～108（相当核基因组的1％）从功能上看，质粒上存在核内没有的基因，赋予了原核生物并非必不可少的特殊功能，如：产毒、接合、抗药、固氮等。从存在形式上看，是一种复制子，分为严紧型复制（与核染色体的复制同步）与松弛型复制（不与核染色体的复制同步）。（二）原核生物的质粒少量质粒可在不同菌株间转移，如：F因子或R因子等。有些质粒具有与核染色体发生整合或脱离的功能，称附加体.如F因子。此外，质粒还有基因重组功能，可在质粒间、质粒与核染色体之间发生基因重组。一些有代表性的质粒：

F因子、R因子、Col质粒、Ti质粒、巨大质粒、Ti质粒。Ti质粒：亦称诱癌质粒主要存在于根癌菌株中，由Ti质粒引起植物的根癌。巨大质粒：比一般质粒大几十倍至几百倍。其他质粒：降解性质粒只存在于假单胞菌属，能够编码可降解复杂物质的酶类。返回目录几个重要概念：基因突变：简称突变，是遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传性的变化，可自发或诱导产生。野生型菌株：从自然界分离到的菌株，简称野生型。突变株：即野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。

第二节基因突变和诱变育种一、基因突变（一）突变类型根据突变的菌株能否在选择性培养基上加以鉴别，可分为：选择性突变和非选择性突变两大类。前者在选择性培养基上通过表型就可以区别开，主要有：营养缺陷型、抗性突变型、条件致死突变型；后者在选择培养基上不能用表型区别开，主要有：形态突变型、抗原突变型、产量突变型。——非选择性突变形态突变型：指个体形态或群体形态因突变而与野生型不同。例如：S形菌落突变为R形菌落，鞭毛有无或荚膜有无的突变。抗原突变型：由于突变使抗原结构与野生型不同。如：细胞壁缺陷变异（如L型细菌）。产量突变型：通过基因突变而获得在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。若产量显著高于原始菌株者称正突变，反之则称负突变。突变率：某一细胞（或病毒粒子）在某一世代中发生某一性状突变的几率。如突变率为10-8表示细胞在1亿次分裂过程中，会发生1次突变。突变是独立发生的，互相不影响，同一细胞中同时发生两个或两个以上突变的几率极低。双重或多重突变的几率是各个基因突变几率的乘积。（二）突变率自发性：是在没有人为干涉的条件下产生的突。不对应性：指突变性状与引起突变的原因之间无直接的对应关系。稀有性：一般突变尤其是自发突变，几率极小（几率为10-6-10-9）。独立性：某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。可诱变性：使用诱变剂，可显著提高突变几率，在遗传育种上较常用。稳定性：突变后的新性状可以稳定地遗传给下一代。可逆性：由野生型基因变异为突变型基因，称正向变异。由突变型基因返回到原始的野生型基因，称回复突变。（三）突变的特点7个共同点：变量试验大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(在同一个大管中作整体培养)(培养前先分成50小管)

3714435抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数涂布试验涂布敏感菌5×104个共12个平板5×104个菌落5000个细菌/菌落6个平板共353个菌落6个平板共28个菌落喷入T1保温重新涂布后喷入T1保温结论：该抗性突变发生在与噬菌体T1接触之前，噬菌体的加入只起到甄别该类自发突变是否发生、存在，决不是诱发该类突变的原因。诱发突变：简称诱变，指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变几率的手段。1.诱变机制诱变剂：能够提高突变几率的任何因素。碱基的置换

移码突变

染色体畸变（1） 碱基置换它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于典型的点突变。嘌呤置换嘌呤（嘧啶置换嘧啶）——转换嘌呤置换嘧啶或者嘧啶置换嘌呤——颠换

A..TA..TA..TG..

CA..BU酮式G..BU烯醇式置换G..

CA..BUG..

BUA..BUG..

CA..T烯醇式酮式（2）移码突变指诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸增加或减少，从而使该部位后面的全部遗传密码的阅读框架改变，引起转录和转译错误的一类突变。移码突变属于DNA的轻微损伤，也是一种点突变，由移码突变所产生的突变株称为移码突变株。移码突变的几种情况如下图示

移码突变的结果：正常链上增加或是缺失1、2或4、5个碱基时，均可引起移码突变，而增加或缺失3或6个不影响读码，只引起较短的增加或缺失。（3）染色体畸变包括染色体结构的缺失、重复、插入、易位、倒位几种情况，也包括染色体数目的变化。1〉染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化，上述几种均可发生。倒位：断裂下来的一段染色体逆转，然后，重新插入到原位置。易位：断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入同一染色体的其他部位上。2〉染色体间畸变：非同源染色体间的易位。一小段DNA断下后，可跳到另一条染色体上插入；质粒上的DNA跳到另一个质粒上，此种情况亦属于染色体间畸变。（原核微生物仅一条染色体，不存在“另一条”。)严格地说，DNA从一个细胞跳到另一个细胞的易位，亦属于染色体间畸变。总之，原核、真核微生物都存在染色体间畸变。2.自发突变机制自发突变：生物体在无人工干预下自然发生的低频突变。自发突变的原因一般有：背景辐射和环境因素的诱变例如：宇宙辐射、南北极磁场等。微生物自身有害代谢产物的诱变效应例如：过氧化氢、过氧化物等。DNA复制过程中碱基配对错误引起据统计，DNA链在每次复制中每个碱基对错配频率是10-7-10-11，这样一个基因的自发突变几率约为10-6。

紫外线对DNA的损伤是引起相邻嘧啶形成嘧啶二聚体（TT，TC，CC）。造成局部DNA分子无法配对。微生物有多种修复受损DNA的作用，现举两例：光复活作用经紫外线照射诱变的微生物立即暴露在可见光下，则微生物的死亡率和突变率将明显降低的现象，称光复活作用。机理：诱变形成的嘧啶二聚体在暗处结合光激活酶，在有可见光的情况下，此酶吸收光能，解离嘧啶二聚体。

暗修复作用又称切除修复，经紫外线诱变损伤的DNA在不见光的条件下，依靠微生物体内的四种酶来修复受损的DNA。即：内切核酸酶、外切核酸酶、DNA聚合酶、连接酶。过程如下图（六）紫外线对DNA的损伤及其修复二、突变与育种（一）自发突变与育种从生产中育种在利用微生物进行大生产的过程中，微生物会以10-6左右的突变率自发突变，其中可能出现一定几率正突变株。2)定向培育优良菌株。利用自然突变，对微生物群体采用特定的选择条件选育出优良菌株。但总的来说，方法古老，自发突变的目的性不强，周期长。（二）诱变育种

诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。（无目的的诱变，有目的的筛选）诱变育种的基本环节出发菌株计算出诱变大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率多数幅度小少数幅度大高产率投产率多数不宜投产少数适宜投产2、诱变育种应考虑的几个原则：

选择简便有效的诱变剂，如紫外线、激光和离子束，烷化剂、碱基类似物等。

艾姆斯试验(Amestest）：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效的方法.

利用微生物营养缺陷型（his—）的回复突变来检测环境或食品中化学致癌剂。（“三致”致癌，致畸，致突变）艾姆斯试验(Amestest）：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效的方法.

利用微生物营养缺陷型（his—）的回复突变来检测环境或食品中化学致癌剂。（“三致”致癌，致畸，致突变）保温可疑“三致”试样鼠肝匀浆（含羟化酶）吸入滤纸片S.t.his阳性阴性S.t.his回变挑选优良的出发菌株。A.选生产中的自发突变菌株;B.已具有优良性状的菌株;C.对诱变剂敏感性较高的菌株等。处理单细胞或单孢子悬液。目的：使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯菌落。选用最佳诱变剂量。紫外线的剂量指强度与作用时间之乘积;化学诱变剂的剂量则以在一定外界条件下，诱变剂浓度与处理时间来表示。充分利用复合处理的协同效应。该法包括同一诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂的先后或同时使用。利用和创造形态、生理与产量之间相关指标。如淀粉水解试验，就是利用淀粉酶变色圈（用碘液显色）的大小来估计突变代谢产物量的多少。设计或创造高效筛选方案。如在实际中，筛选工作常分为初筛和复筛两步进行。3、营养缺陷型突变株的筛选（重点）1）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基①基本培养基（MM，[-]）：仅能满足某一微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基，（该培养基都是人工培养基，营养缺陷型菌株不能在其上生长）。②完全培养基（CM，[+]）：所有营养缺陷型菌株均可在其上生长的培养基。一般地，完全培养基是天然或半人工合成的。③补充培养基（SM，[A]、[B]或[AB]）：凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基2）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类遗传型个体①野生型：从自然界分离到的没有发生过任何突变，可以在基本培养基上生长的菌株。②营养缺陷型：野生型菌株因为突变，失去了合成某种酶的能力，使得该酶产物不能产生，只能在加有这种产物的培养基上生长的菌株。该型不能在[-]上生长，只能在[+]或相应的补充培养基上生长。该型非自身合成。③原养性：营养缺陷型经回变或其他的基因改造，回复为与野生型相同的形状的菌株.（与野生型从现象上无任何区别。）3）营养缺陷型的筛选方法一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个步骤。①步诱变剂处理：与一般诱变处理相同②步淘汰野生型（即筛选出基因突变的类型），现举两种方法。A．抗生素法（最常用）。

a．青霉素：抑制细胞壁肽聚糖的合成，故可杀死生长、繁殖状态的细菌，对休眠状态的无用。方法：将诱变后的菌培养到含青霉素的基本培养基上，即野生型被淘汰，留下的为休眠状态的营养缺陷型。

b．制霉菌素：主要与真菌细胞膜上的甾醇作用，引起膜损伤。方法：将诱变后的孢子培养到含制霉菌素的基本培养基上，基本培养基长出菌丝者为营养缺陷型。B．菌丝过滤法：适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。可用大孔擦镜纸反复过滤筛选出。A．夹层培养法（“三明治”状）

③步检出缺陷型现举出四种方法：小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）B．限量补充培养法

在基本培养基上，加微量的天然成分（不同于补充培养基），营养缺陷型形成微菌落，而野生型形成正常大小的菌落。微量蛋白质的完全培养基上小菌落是营养缺陷型突变株C．逐个检出法将诱变处理的细胞涂在含有完全培养基的平板，长成菌落，再将其接种至基本培养基上不长菌落（为营养缺陷型）。含诱变剂的液体培养基菌种涂布培养基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落营养缺陷型D．影印平板法完全培养基影印接种基本培养基将诱变处理的细胞涂不于含有完全培养基的平板，长出菌落，利用影印接种工具将该菌落转移到另一个基本培养基上培养，亦长出菌落，将前后相应菌落对比，若前者生长，而后者不生长的菌落，为营养缺陷型（类似“平板影印培养试验”）。④步鉴定缺陷型（采用生长谱法）生长谱法:指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物,视某营养物的周围有否长菌来确定供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。操作：将营养缺陷型细胞（或孢子）洗下，用无菌水离心清洗，制成菌悬液并与基本培养基混合培养，用含有不同营养物的滤纸片覆盖，如某滤纸片周围有微生物生长圈，则为该营养物的营养缺陷型。该法优点：方法简便，不怕污染菌，回复突变细胞不影响结果，此方法又可测定双重或多重营养缺陷型。返回目录

第三节基因重组

基因重组的定义：把两个不同性状个体的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的遗传型个体的方式，称基因重组或遗传重组。基因重组可以理解成遗传物质分子水平上的杂交，即核酸水平上的杂交。而传统意义上的杂交通常指的是细胞水平的杂交，如杂交动物、杂交植物等。但所有细胞水平上的杂交都是以基因重组为基础的。微生物的基因重组分原核微生物和真核微生物两大类进行研究。一、原核微生物的基因重组

原核微生物的基因重组包括转化、转导、结合和原生质体融合等四种形式。（一）转化

受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换、把它整合到自己的基因组中，从而使受体菌获得了供体菌的部分遗传性状的现象称为转化。转化的结果是形成转化子。即转化子是通过转化获得供体细胞部分遗传物质并表现出相应性状的重组受体菌。而来自供体菌的DNA片段称转化因子。转化过程见下图

（一）转化

两个菌株间能否发生转化与多种因素有关，如两个菌株进化过程中的亲缘关系、供体DNA的形式及菌株的具体生理状态等，其中最重要的是受体菌生理状态——感受态。供体的DNA片段形式：不同形式的供体菌DNA片段，发生转化的频率也有区别，其中质粒形式的DNA片段发生转化的频率最高。（一）转化

转染：将噬菌体或病毒的DNA或RNA提取出来，再去感染感受态的宿主细胞，进而产生正常噬菌体或病毒后代的现象叫转染。转化与转染的不同：转化是受体菌接受供体菌的DNA片断、发生基因重组并产生转化子。转染过程不发生基因重组，受体菌仅接受噬菌体或病毒的DNA或RNA、不产生杂种性质的转化子，产生的是大量的子代噬菌体或病毒。（二）转导

转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，将供体菌的DNA片段携带到受体菌中，通过交换、整合，使后者获得前者遗传性状的现象，称之为转导。转导子：通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子。转导噬菌体：携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒。分类：普遍转导局部转导（二）转导转化与转导的区别：转化：受体菌直接接受供体菌DNA片段。转导：受体菌通过噬菌体接受供体菌DNA片段。

１、普遍转导（1）完全普遍转导完全缺陷噬菌体：当某噬菌体感染供体菌后，在供体菌内增殖时，使供体菌的DNA被切成许多片段，成熟后少数衣壳将供体菌的DNA片段（要求与噬菌体核酸片段相仿）“误包”，形成假噬菌体，即完全缺陷噬菌体;当供体菌被裂解此完全缺陷噬菌体释放后，再次感染受体菌，即可把外源（供体菌）的DNA片段介导到受体菌中，实现交换和整合，这就是完全普遍转导。完全普遍性转导(compietetransduction)供体A-B+A+B-多数受体形成溶源菌A-B+A+B-少数受体A+B+经重组形成转导子A-B+色氨酸缺陷型A+B-组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌

（2）流产普遍转导完全缺陷噬菌体感染受体后，所携带的DNA片段没有和受体菌的DNA片段交换、整合、复制，但可以转录、翻译产生相应的代谢产物，有相应的表型；受体菌再经分裂、繁殖，子一代只有一半获得供体菌的DNA片段，另一半仅得到部分代谢产物表现出轻微的供体菌特征，在继续分裂的过程中，逐渐被稀释，此现象称为流产普遍转导。见下图：

2、局部转导部分缺陷噬菌体:温和噬菌体感染受体菌后，使宿主溶源化。该溶源菌因诱导发生裂解时，其中极少数的前噬菌体会发生不正常切离，将噬菌体结合位点两侧之一的少数基因连接到噬菌体DNA上，同时噬菌体也会将相应的一段DNA留在宿主染色体组上，最后噬菌体的衣壳将非正常切离的噬菌体染色体进行误包，即形成了部分缺陷噬菌体。

2、局部转导定义：通过部分缺陷的温和噬菌体将供体的少数特定的基因携带到受体菌，并得到表达的转导现象，称之为局部转导.局部转导的特点：（1）只能转导供体菌的个别特定基因（噬菌体整合位点两侧的基因）。（2）特定基因由部分缺陷型的噬菌体携带。（3）缺陷噬菌体是由于其在形成过程中产生的低频率“误切”，或双重溶原菌的裂解而成。分类：局部转导按其转导频率的高低可分为低频转导（LFT）和高频转导（HFT）两大类。

（1）低频转导（LFT）温和噬菌体感染受体菌后使宿主溶源化，该溶源菌因诱导后发生裂解，形成10-5比例的部分缺陷噬菌体，他们感染受体菌后发生交换、整合，形成转导子（局限转导子），而不是溶源菌，不具免疫性，亦称低频局限转导。见下图

（2）高频转导（HFT）用低频裂解物（含10-5的部分缺陷噬菌体）来感染受体菌，即有10-5变为低频局限转导子，再用高感染复数的正常噬菌体去感染低频转导子，此时的低频转导子称为双重溶源菌，它被诱导后可产生裂解，正常的噬菌体可协助缺陷噬菌体进行等量复制，用这样的裂解物（高频裂解物，含50%正常噬菌体）再去感染受体菌，进行高频转导，亦称高频局限转导。（三）溶源转变温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，将噬菌体的基因整合到宿主的核基因组形成前噬菌体，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。溶源转变与转导的区别：1、温和噬菌体本身不携带外源基因，使宿主带有新性状的是噬菌体本身的基因。2、温和噬菌体是完整的非缺陷的。3、获得新性状的是溶源化的宿主细胞而不是转导子。4、获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失。（四）接合供体菌（雄性）通过性菌毛与受体菌接触，前者将不同长度的单链DNA片段传递给后者并在后者细胞中双链化，进一步与核染色体交换、整合，使受体菌获得供体菌部分遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得供体菌性状的受体细胞，称为接合子。通过细胞间的直接接触能进行大段ＤＮＡ的转移的过程，叫接合接合及其发现+A+B+C-D-

A-B-C+D+

A+B+C+D+（四）接合以E.coli为例，按细胞内有无F因子及其存在方式的不同可分为四种：1、F+（雄性）菌株有游离的F因子1—4个，体外有对应数量的性菌毛，当其与F-菌株接合时，通过性菌毛可将F因子传递给后者，使之转变为F+菌株。2、F-(雌性)菌株体内无F因子，体外亦无性菌毛，它可通过与F+菌株、F′菌株或Hfr菌株接合而接受F因子或F′因子，使自己变成“雄性”菌株，也可接受来至Hfr菌株的一部分或全部遗传信息。

3、Hfr（高频重组）菌株因其与F-菌株结合后，发生重组的频率比F+要高数百倍，故得名。在这样的菌体内，F因子呈整合状态，整合位点固定；当它与F-结合时，Hfr菌株的染色体在F因子处断裂，由环状变为线状，F因子位于线性DNA的末端。然后整条线性染色体以等速转移至F-菌株内，因转移所需时间较长，且容易发生中断，导致Hfr与F-结合的结果其重组频率最高，但转性频率最低。

4、F′菌株当Hfr菌株内的F因子因不正常切离而脱离染色体时，形成带了一小段Hfr染色体基因的特殊F因子，即F′因子。此时的性状界于Hfr与F+菌株之间，称初生F′菌株；F′菌株与F-菌株结合，后者也变成F′菌株。它既获得了F因子，又获得了来自初生F′菌株的若干新性状，成为次生F′菌株。次生F′细胞是一部分双倍体。以这种结合来传递供体基因的方式，称为F因子转导、性导、F质粒媒介的转导。(五)原生质体融合

通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、稳定的融合子的过程。

原生质体融合的主要步骤：①亲本选择选择两个有特殊价值的，并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本；②原生质体制备在高渗溶液中，利用脱壁酶（溶菌酶）进行亲本脱壁，形成原生质体；③原生质体融合加入促融合剂（如PEG）或电脉冲等促进融合；④融合子鉴定先在能使细胞壁再生的培养基上进行涂布培养，待形成菌落后，再影印接种到选择性培养基上，鉴定其是否为融合子；⑤生物学性状及生长性能测定。原生质体融合(protoplastfusion)二、真核微生物基因重组（一）有性杂交：凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都可以通过性细胞的接合而发生的染色体重组，产生新遗传型后代。

（二）准性杂交比较原始的一种通过体细胞进行融合，不经过减数分裂的低频率重组现象。

（二）准性杂交主要步骤：1.菌丝结合：两个遗传性状不同的单倍体菌丝细胞相互接触，叫菌丝结合或菌丝联结。2.形成异核体：两个细胞经联结后，细胞发生融合，原生质体混杂在一起，而细胞核单独存在，可独立生活。3.核融合：两个细胞的核膜融合在一起，形成双倍体杂合子核（不稳定）。此