转基因小鼠制备

基因准备实验用鼠的饲养小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。本项试验将全部应用C57/BL6XDBA杂交的F1代小鼠。转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。2.1供体鼠一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。一般用4〜6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。2.2受体鼠（即假孕母鼠）母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。母鼠一般4〜5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20〜25%进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2〜3只母鼠。也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2〜4只母鼠。一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。2.3结扎公鼠结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。用作母鼠假孕的结扎公鼠需8周龄以上，对种系无特殊要求。在作正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要和3只母鼠交配，使母鼠只产生阴栓而均不怀孕，方可投入正式实验。结扎公鼠可每晚与母鼠交配，但最好是隔日一次。结扎公鼠使母鼠产生阴栓的能力可维持两年。每只结扎公鼠最好有使母鼠产生阴栓的记录，如经4〜6次都不能使母鼠产生阴栓，则所用结扎公鼠必须更换。如每月作9次显微注射，每次需4〜8只假孕母鼠，则需结扎公鼠20只。2.5超数排卵3〜8周龄供体母鼠在12〜14小时光照周期（上午6:00至下午6:00或上午7:00至下午7:00）的动物房内饲养3〜5天，即可超数排卵。一般都采用PMSG和HCG联合使用进行超排。用量每只母鼠都为5至7.5国际单位。一般为冰冻干燥的粉剂，均用生理盐水或PBSG溶解500国际单位/ml，分装于1.5ml离心管中，每管0.1ml，贮存于-20°C，有效期至少一个月。使用前加0.9ml生理盐水稀释至50IU/ml，每只供体母鼠腹腔注射0.1〜0.2ml0P5〜10个国际单位）。PMSG与HCG注射的间隔时间，二者与动物房光照周期关系均影响超排卵效。一般PMSG与HCG注射间隔46〜48小时，排卵发生于注射HCG后10〜13小时。为精确地控制排卵时间，HCG的注射必须在内源LH释放之前。PMSG刺激内源LH的释放受动物房光照周期的调节。内源LH的释放随种系而异，对大多数种系其释放在PMSG注射笫2个暗周期的中点之后16〜20小时。如暗周期是晚6点至早6点，PMSG在下午1〜2点注射，46〜48小时后注射HCG，这一注射时间约在内源LH释放之前2〜3小时。腹腔注射PMSG后，供体母鼠仍置原笼内，待两日后注射HCG，注射HCG后每只母鼠置于1个单笼饲养的结扎公鼠笼内，次晨检查阴栓。小鼠胎儿成纤维细胞培养体系的建立3.1材料DBA公鼠与C57母鼠配种怀孕13.5d的小鼠胎儿。细胞培养板（六孔）、低速台式离心机、CO2培养箱、净化工作台、冷冻管、10mL玻璃离心管。DMEM/F12、胎牛血清。0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液：称取0.04gEDTA完全溶解于100mLD-Hank's液，用1mol/L的NaOH调PH至7.2-7.4，然后称取0.05g胰酶溶解其中，过滤除菌后分装，-20°C保存。细胞培养液：DMEM/F12+FBS(终浓度为10%)+PS。D-Hank's液：NaCl8g+KCl0.4g+Na2HPO40.05325g+KH2PO40.06g+NaHCO30.35g,加水至1000mL，调PH=7.2,高压灭菌，4C保存。3.2方法3.2.1小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养(消化法)手术取13.5日龄胎儿置于盛有D-Hank's液的广口瓶中。用加PS的D-Hank's液冲洗2~3遍，移入另一个平皿。去除胚胎的头、四肢、内脏，将剩余部分转移至另一平皿。将眼科剪将其尽量减碎，加入D-Hank's液吹打散开，吸去漂浮的脂肪组织等，并吸尽液体。再吸入适量D-Hank's液冲洗1遍，再剪，再用D-Hank's液冲洗，直至冲洗液清亮。将剪碎的组织放入一10mL玻璃离心管中，再加入约组织量5倍的消化液进行消化，反复吹打。当溶液出现明显浑浊后，静置一段时间后将上层浑浊液吸入到新的10mL玻璃离心管中，1500rpm，5min。去上清，用D-Hank's液重悬离心2次，1500rpm，5min。去上清，加成纤维细胞培养液重悬，进行细胞计数，铺六孔细胞培养板，置于37C、5%CO2培养箱中培养。步骤(6)中微小化沉淀物加消化液进行第2次消化，重复步骤(6)-(9)，至步骤不再消化(吹打液不再浑浊)。3.2.2小鼠胎儿成纤维细胞的继代培养(1)待培养皿中90%铺满单层细胞时，吸去原有培养液，用D-Hank's冲洗细胞2次。(2)加入0.05%胰酶+0.04%EDTA消化处理并置于37C培养箱直到贴壁的胎儿成纤维细胞基本变圆。加入成纤维细胞培养液终止消化。收集细胞混悬液，1500rpm离心5min,除去上清。用培养液重悬细胞，吸取悬液铺入六孔板中，置37°C、5%CO2的培养箱中继续培养。细胞反复消化培养3代至培养孔中杂细胞基本消失。3.2.3细胞的冻存与复苏冻存：弃去旧培养液，用D-Hank’s清洗两遍。加消化液约2min，吹打悬浮细胞，移入离心管，1500rmp，离心3min。D-Hank’s液洗一遍，弃废液，再用配好的冻存液(含20%FBS，含10%DMSO的DMEM/F12)细胞，加入冻存管中。-4C15min，-20C2h，然后放入-75C冰箱过夜，最后放入液氮中保存。复苏：从液氮瓶中取出快速放入37C中水浴。融化后加入10倍左右的DMEM/F12培养液，离心(1000rpm/min)10min，去上清，加入培养液，最后稀释使细胞浓度为1X106个/ml。放置在37C，饱和湿度，5%CO2的培养箱中，细胞贴壁后更换培养液。基因转染胎儿成纤维细胞及细胞株的建立5.1材料Multiporator(effendorf，德国)、低速台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养六孔板、单人双面净化工作台、自动双重纯水蒸馏器、数码凝胶图像处理系统、DNA扩增仪。DMEM/F12、G418、LUTEOTROPICHormone、Hypoosmolarbuffer。其它试剂为国产分析纯级，分别购自南京科威公司、上海华美公司、上海生工公司、上海药剂等。0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液：称取0.04gEDTA完全溶解于100mLD-Hank's液，用1mol/L的NaOH调PH至7.2-7.4，然后称取0.05g胰酶溶解其中，过滤除菌后分装，-20C保存。G418筛选培养液：DMEM/F12100ml+G41810.000g，过滤除菌，分装1ml/管，-20C保存。D-Hank's液：NaCl8g+KCl0.4g+Na2HPO40.05325g+KH2PO40.06g+NaHCO30.35g，加水至1000mL，调PH=7.2，高压灭菌，4°C保存。5.2方法5.2.1细胞对G418的耐受性实验选择生长均匀、形态正常的细胞消化后，计数。取两块6孔细胞培养板，向每孔中接种1ml含2〜5X105个细胞的培养液，37C、5%602的加湿培养箱中培养至50%〜70%汇合。分别向1至8孔中加入G418。每孔浓度分别为100Pg/ml、200Pg/ml、300Pg/ml、400Pg/ml、500Pg/ml、600Pg/ml、700Pg/ml、800Pg/ml。第9、10、11、12孔作为空白对照。每两天换培养液一次，每天观察细胞的生长情况并记录。5.2.2电转染用电压、脉冲时间的优化电转染时电压和脉冲时间是影响细胞存活率和转染率的最主要因素，许多研究表明，电转染后细胞存活率在50%左右的电学参数就是较为理想的转染参数。本实验以电压100V、150V、200V、250V和脉冲时间60期、80期、100网、120期分别电击P3代小鼠胎儿成纤维细胞，电穿孔结束后将电转染液转移至六孔细胞培养板中并补加正常的乳腺上皮细胞培养液后置培养箱中培养24小时，然后消化贴壁细胞计数细胞数，计算出细胞存活率。5.2.3基因电转染小鼠胎儿成纤维细胞弃去原培养液，用D-Hank's液冲洗2遍。加入0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液消化，2min左右后弃去大部分消化液。待大量细胞变圆时，用含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化。轻轻吹打分散细胞，并加A1mL左右D-Hank's液一起移入离心管中。同时，吸取少量悬液进行细胞计数。其余的细胞悬液在室温条件下，1500rpm离心5min。将细胞计数板平放于显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴加细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。在镜下观察细胞，根据细胞数量调整细胞密度，使细胞密度达到200个〜500个/10mm2。在显微镜下对细胞进行计数，活细胞胞体完整，透明不着色，凡着色者均为死细胞。计算四角大方格内的细胞数，压线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内。然后按下列公式计算:细胞数/毫升原悬液=(4大格细胞总数/4)X10000X稀释倍数离心后，弃去上清。加入1mLHypoosmolarElectroporationBuffer悬浮细胞，1500rpm离心5min，弃上液。将细胞重悬于HypoosmolarElectroporationBuffer，使细胞达到1~3X106cells/mL。吸取400pL细胞悬液加入基因片段并混合，DNA的终浓度应为5~20pg/mLo将400pL的细胞悬浮液转移进electroporationcuvettes(径宽2mm)，细胞悬浮液中应没有气泡。Multiporator中电穿孔：ModeEukaryotes"。"Voltage(V)200VTimeconstant(t)100psNo.ofpulsees(n)1次(10)电脉冲后，使细胞悬浮液在cuvette中室温条件下静置7min。(11)将细胞悬浮液分别加入六孔含正常胎儿成纤维细胞培养液的六孔板中，37°C、5%CO2、饱和湿度条件下静置培养。5.4药物筛选细胞电转染48h后进行药物筛选，并准备没有转染外源基因的胎儿成纤维细胞作为阴性对照；在转染的细胞和阴性对照的细胞中同时加入含G418700pg/mL的DMEM/F12培养液进行筛选，以后每两天换一次液，并在倒置显微镜下进行观察；筛选三周左右，在显微镜下可以观察到有明显抗性的克隆细胞株产生，此时将细胞G418的筛选浓度降低至400pg/mL继续培养。5.5细胞株的扩大培养在G418筛选2~3周后，可见明显的细胞克隆团。挑选生长旺盛、细胞形态好的细胞株，在六孔板底部做上标记。吸去旧培养液，用D-Hank's清洗2遍，然后将克隆环自制)的底部一圈涂上灭菌凡士林，轻轻放在底部做有标记的地方并稍压紧。接着往环内加入50L的胰酶消化液消化细胞，在显微镜下观察到细胞开始变圆时，加入DMEM/F12终止消化并用枪头轻轻吹打以悬浮细胞，然后将细胞悬液转移到24孔细胞培养板中，同时补加500L新鲜的含200g/mLG418的胎儿成纤维细胞培养液。待细胞长满24孔板后将其转入六孔细胞培养板中扩大培养。5.6细胞株的PCR检测5.6.1细胞染色体DNA的提取(考虑单细胞检测)待细胞基本长满6孔板底壁时，用D-Hank's冲洗细胞2~3次，加入消化液消化细胞，待大部分细胞变圆时加入适量培养液以终止消化。取细胞消化液加入离心管，1500rpm离心5min。弃上清，加入500L的灭菌三蒸水悬浮细胞，轻弹管壁，使之充分混合，12000rpm离心5min。重复步骤⑵次。加2001缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。加入20L蛋白酶K溶液，混匀。加2001缓冲液GB，充分颠倒混匀，70C放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70C放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。加入200L无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入5001缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入700L漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500pL漂洗液PW,12000rpm离心30s,倒掉废液。将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200pL洗脱缓冲液TE，室温放置2~5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50PL，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的获得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm离心2min。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0~8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率，且DNA产物应保存在-20°C，以防DNA降解。(15)用0.75%的琼脂糖电泳检测定量。5.6.2PCR检测9引物序列：目标产物长度：PCR反应体系:组成成份体积终浓度10XPCRbufferpLdNTP(10mM)pLpM引物I(CMV+LYZ1，10pM)pLpM引物II(CMV+LYZ2,10pM)pLpM模板DNApLTaq(5U/pL)pL灭菌双蒸水pL反应总体积为pLoPCR循环参数为：重组胚胎的制备和培养从单细胞到囊胚的植入前的胚胎(受精后0.5到3.5天)，可转移至假孕母鼠的生殖道以完成发育。单细胞至桑椹胚的胚胎转移至同步发情或略早的假孕母鼠的输卵管，这种输卵管胚胎移植仅适用于被透明带包裹的卵；3.5天的囊胚转移至2.5天假孕的母鼠子宫，用于子宫胚胎移植胚胎不需有透明带。将胚胎转移至假孕母鼠的较早阶段是为了给胚胎以充足的时间使其赶上发育阶段。6.1材料6.1.1试剂及配方M2；M16；透明质酸酶；75%酒精；0.75%戊巴比妥钠；细胞松弛素B；氯化锶。6.1.2仪器设备毛细玻璃管、拉针仪。CO2培养箱、体视显微镜、小鼠用手术器械、显微操作系统、piezo系统；培养皿、酒精灯、胚胎培养杯、玻片等。PVP、PVA6.2方法6.2.1显微注射针的准备用断针仪垂直断开吸管末端，形成一个平的端口。平口吸管可以穿过透明带和卵质膜，而对卵的损伤降低到最小程度。去核针的内径约为7〜即m。注射针的内径应根据供体细胞的大小和硬度进行调整。对于卵丘细胞核原生殖细胞，内径大小为4〜5pm；对于成纤维细胞为7〜叩m。6.2.2卵母细胞的收集制备移卵管。制作液滴。快速颈椎脱臼法处死雌性供体小鼠。将小鼠放在吸水纸上，用75%的酒精消毒腹部。用手指捏住皮肤并用眼科弯剪在皮肤上做一小切口(具体的位置不一定很严格)。然后用力将皮肤拉到头部，完全暴露腹部。然后剪开腹膜，完全暴露内脏器官。将肠管拉向一侧后即可在腹腔中见到两侧的子宫和相连的卵巢。卷曲的输卵管在卵巢和子宫之间。用眼科镊夹住子宫将其提起，这有利于将子宫和腹膜分离开。用显微剪在膜上刺破一小口，然后将子宫分离下来。仍用镊子夹住子宫，用显微剪在卵巢和输卵管之间剪开。切口必须尽可能的接近输卵管。将镊子移到输卵管处夹住输卵管(小心的夹紧)，在输卵管和子宫之间在剪一刀。将输卵管放入含有M2液滴的平皿中。将另一侧的输卵管按同样的方法取下来，接下来将其余所有供体的输卵管都取下来。所有的输卵管都要收集在同一个M2平皿中。在显微镜下观察输卵管(10〜20倍放大)，可见其为具有一透明的膨大部的不透明的一团。膨大部形成的原因是因为卵子团集在这里(许多受精卵外都包围着颗粒细胞)。可以透过膨大部见到受精卵。用一个镊子夹住输卵管，另一个镊子将膨大部撕开。小心控制输卵管的方向以便可见到卵团溢出输卵管。如果卵团没有立刻溢出输卵管，要用镊子将其轻轻地拉出。将空的输卵管丢弃，接下来重复以上的程序将剩余输卵管内的卵团取出。偶尔，个别输卵管的膨大部会不明显。在这种情况下就必须将输卵管完全撕开来收集卵子。用移卵管将收集所有的卵子并将其转移到另一个含有M2液滴中。用移液管吸取适量解冻的透明质酸酶存贮液于卵团混匀。反复吹吸卵子将加快分离。用吸管将受精卵移入第三个M2液滴。不断的将受精卵收集起来移到该平皿的另一液滴。在每一次的受精卵转移过程中都有一小部分颗粒细胞被洗掉，以至于在最后一次转移时颗粒细胞以被完全除去。然后将受精卵转移到新的M2液滴中。在其中一个平衡了的M16中将受精卵清洗两次。将受精卵转移到含M16的方杯培养并放在37°C、5%CO2的培养箱中培养。6.2.3卵母细胞的去核10〜20个卵母细胞为一组，放于玻片上含细胞松弛素B的培养液滴内，并将玻片置于显微操作仪的操作面。固定卵母细胞，并使其中期位于2点至4点之间的位置。将去核针的顶端置于透明带的表面。将染色体随少量的胞质一同吸去。将一组卵母细胞完成去核后，在新鲜培养液滴中洗涤数次。将卵母细胞置于培养箱中30min〜2h，再进行供体注射（或电融合）。6.2.4核供体细胞的准备取出饥饿48h后的核供体细胞，用D-Hank's液吹洗2遍。加入适量的消化液，3〜5min后加入正常培养液终止消化，吹打后移入离心管，1500rpm离心5min。去上清，用适量M2重悬离心，1500rpm，5min。最后再用M2重悬移入指形管中以备核移植。6.2.4供体核的注射在显微操作平面上轻轻将乱切细胞混合到PVP滴中。在显微操作平面的一个CZB-HEPES小滴中放置10-20个去核卵为一组。用注射针轻柔地吹打供体细胞从而获得细胞核，然后将工体和在注射针内排成一线。在施加数个piezo脉冲的同时，将注射针向前推进并穿过透明带，将注射针深深插入到卵质中，同时将供体核推到吸管的顶端。将注射针置于卵内数秒，施加一个凭经验决定的最小强度piezo单一脉冲。质膜将会在吸管顶端的位置被穿破，质膜被穿破的标志是该处卵质膜迅速松弛。连同最小量的培养液将供体核排出到卵质膜内。轻轻地撤回注射针（相对而言先快后慢）。注射后的卵置于室温下5-10min，然后洗涤并在CZB培养液中继续培养，直到用锶活化。6.2.5胚胎活化和培养核移植后约1h后，将卵置于无钙、含2.5〜10mmol/L氯化锶及5Pg/mL细胞松弛素B的培养液中，37°C,5%CO2条件下活化。1h后，将已活化的卵移入到含5pg/mL细胞松弛素B的培养液中，继续培养5h。重构胚在新鲜的培养液重洗涤数次，继续培养直到进行胚胎移植。输卵管胚胎移植法小鼠用手术器械用高压消毒。切口位于脊柱左侧lcm，约与最后1根肋骨平齐。小鼠用0.2ml1%戊巴比妥钠麻醉后，剪去鼠后背部被毛，用70%酒精消毒。在鼠完全麻醉时，用手术剪在术部剪开一个长0.5cm的小口。用镊子沿切口钝性分离皮肤肌肉，透过腹膜可见卵巢（桔黄色）和脂肪垫（白色）。然后用显微外科镊在相当于卵巢上部的腹膜开1个小口。这时应避开血管以防出血。用无齿镊夹住脂肪垫并带出左侧的卵巢、输卵管与子宫。用动脉夹夹住脂肪垫并将其放在鼠背后皮肤上，这样卵巢与输卵管保留在腹膜外。鼠可于手术前即置于解剖镜下，如打开腹膜后再移动，事先最好将鼠放在一只塑料盘上，一般头在左侧，脂肪垫翻向后，输卵管在显微镜视野中心。在解剖镜下可见位于卵巢囊里的输卵管和卵巢，用两只显微外科镊在相当于输卵管开口上部将透明的囊膜打开一小口，尽可能避开血管以防出血。用显微外科镊轻轻拨动输卵管喇叭口使其呈水平状，将移卵管从开口部插入输卵管，吹移卵管直至第二、第三个气泡进入壶腹部。将移卵管略停一下再拔出，以防气泡和卵逸出，可按上述方法将胚胎转移至右侧输卵管。去脂肪夹，用钝头镊子夹住脂肪垫，带动卵巢、输卵管子宫一并送回腹腔。，可将腹膜缝一、二针，再将皮肤切口缝合。整合检测从G0代胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的DNA，可用PCR（聚合酶链反应）、Dotblot（斑点杂交）、Southernblot（Southern杂交）等多种方法分析，以确定是否为转基因鼠。PCR与Dotblot可较快地提供信息，但PCR易有假阳性，Dotblot在基因拷贝数低或嵌合体时易有假阴性。Southernblot可给出一定长度的区带，不仅提供了外源DNA结构与整合的信息，同时可克服上述方法所造成