饲料中有毒有害物质的测定课件

饲料中有毒有害物质的测定4/14/202319饲料中有毒有害物质的测定P244（一）饲料质量营养质量：饲料营养成分含量；技术质量：饲料的物理特性、如颗粒大小、形状、硬度、适口性等、混合均匀度；卫生（安全）质量：对动物、人和环境的安全；情绪质量：伦理标准或感觉可影响对质量的讨论，如有争议的动物性原料或人造着色剂和调味剂。一、概述公众对饲料质量重要性的认识的变化表1

4/14/202329饲料中有毒有害物质的测定（二）几起典型的饲料安全事故２０世纪８０年代中期至９０年代中期疯牛病（“牛海绵状脑病”）的暴发流行。1999年1月15日以来，比利时、荷兰、法国、德国相继发生因动物饲料被二恶英污染，导致畜禽类产品及乳制品含高浓度二恶英事件。“瘦肉精”中毒问题、“毒奶粉（2008）”、“红心鸭蛋（使用苏丹红，2006）”、“多宝鱼（药物残留，2006）”等。

“配合饲料有毒”、“配合饲料生产的肉蛋奶不能吃”、“小孩肥胖原因是吃了含激素的肉”。

一、概述饲料安全等于畜产品安全！

4/14/20233“饲料鸡”“土鸡”新概念鸡蛋全是“扯蛋”？

4/14/202359饲料中有毒有害物质的测定（三）饲料卫生标准——强制性国家标准

对饲料中有独有害物质及有害微生物以法律形式做出的统一规定。

1991年版《饲料卫生标准》：覆盖面较小，造成许多事故纠纷无判定依据，一些重要的产品卫生指标没有规定等。一、概述4/14/202369饲料中有毒有害物质的测定（三）饲料卫生标准——强制性国家标准

2001年新版GB13078－2001《饲料卫生标准》：

有害物质及微生物卫生指标项目增加了“铬”在皮革、蛋白粉和鸡、猪配合饲料中的允许量指标。即由原标准规定的16项，修订为17项。新版标准覆盖的产品品种达66种，是原标准的3倍多。砷在磷酸盐产品中的允许量指标由每千克产品10毫克，修订为20毫克。氟在磷酸氢钙产品中的允许量指标由每千克2000毫克，修订为1800毫克。黄曲霉毒素B1指标将肉用仔鸡配合饲料分为前期料和后期料，其允许量分别为每千克饲料中10微克和20微克。补充规定了与各项指标相对应的试验方法，消除了原标准没有指明特定试验方法的缺陷。一、概述4/14/202379饲料中有毒有害物质的测定（三）饲料卫生标准——强制性国家标准现行的饲料卫生标准将进行不断的修订和完善！相对于发达国家的饲料卫生标准，我国的饲料卫生标准项目偏少。新农药的不断出现（现行饲料卫生标准只规定了两种农药的限量标准：六六六、滴滴涕）。敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、菊酯类、马拉磷、蚜螨磷安全限量标准草案。测定方法灵敏度的提高，对于某些有毒有害物质限量的规定将可能发生改变。新饲料资源的开发利用。一、概述4/14/20238

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饲料中有毒有害物质的测定砷的毒性：砷与动物体组织中酶的巯基结合使之失活，损害机体全身组织。砷的氧化物毒性很高，三价砷毒性>五价；无机砷毒性>有机砷：砒霜（As2O3

）。一般情况下，植物性饲料砷含量很低。植物饲料中砷含量与土壤中的水平、农药污染和工业污染有关。二、饲料中总砷的测定（P248）4/14/202310

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饲料中有毒有害物质的测定二、饲料中总砷的测定有机砷饲料添加剂：对氨基苯砷酸（阿散酸）、对氨基苯砷酸钠和3-硝基-4-羟基苯砷酸（洛克杀生）。

促生长，抗球虫及着色（使皮肤红润，毛色发亮）等功效。我国制定的饲料中砷测定标准方法是测定饲料中总砷含量（目前的检测方法还不能区分有机砷和无机砷），而卫生标准中砷的限量标准为无机砷，造成了使用有机砷添加剂的配合料，含砷量超过我国国家允许量标准，这也使得检测结果无法依据产品卫生标准进行质量判定。4/14/2023119饲料中有毒有害物质的测定（一）概述黄曲霉毒素（aflatoxins,AF）是由一组真菌（黄曲霉、曲霉等）产生的一组化学结构类似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其饼粕等。对人和动物均具有极强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素还可在动物产品中蓄积，影响人体健康。目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。其中黄曲霉毒B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。在自然条件下，饲料污染的黄曲霉毒素主要为AFB1、B2、G1、G2，其中以AFB1含量最高。黄曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄积性——饲料产品质量控制中的必检项目。

二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定4/14/2023139饲料中有毒有害物质的测定(二)检测方法酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）薄层层析法（thinlayerchromatography，TLC）快速筛选法二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定（P288）4/14/2023149饲料中有毒有害物质的测定酶联免疫吸附法1、原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。特点：很强的特异性：建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上。

很高的灵敏度：酶催化反应。对于黄曲霉毒素B1，ELISA法最低可检出0.1μg。

二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定4/14/202315酶联免疫吸附法A、抗体将某种抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。

9饲料中有毒有害物质的测定4/14/202317单克隆抗体是由生长在细胞培养物中的同一B细胞的群体（一个克隆）合成并分泌的、均一的、识别同一抗原表位的抗体。4/14/202318酶联免疫吸附法B、酶与底物：在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish

peroxidase,

HRP)和碱性磷酸酶(alkaline

phosohatase,

AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸终止酶反应。碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl

phosphate,p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。

9饲料中有毒有害物质的测定4/14/202319酶联免疫吸附法ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。

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饲料中有毒有害物质的测定4/14/202321（1）

直接法测定抗原A.

将抗原吸附在载体表面；B.

加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；C.加底物。底物的降解量＝抗原量。4/14/202322（2）间接法测定抗体A.

将抗原吸附于固相载体表面；B.

加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.

加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量＝抗体量。4/14/202323（4）竞争法测定抗原A.

将抗体吸附在固相载体表面;B.加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。4/14/202325黄曲霉毒素B1酶联免疫竞争检测法

4/14/202326标准品4/14/202329标准溶液4/14/202330酶标抗原4/14/202331酶标抗原酶AFB14/14/202332标准品,样品

和

酶标抗原

加进微孔4/14/202333样品酶标抗原

样品孔先加后加4/14/202334标准品酶标抗原标准孔先加后加4/14/202335孵育30分钟抗原与抗体结合4/14/202336微孔清洗4/14/202337洗涤5次，间隔2分钟4/14/202338加入酶催化反应底物4/14/202339加入反应底物A和B孵育15分钟4/14/202340显色4/14/2023414/14/202342反应孔4/14/202343阴性对照孔4/14/202344阴性对照孔=没有黄曲霉毒素B1分子与酶标抗原竞争所有抗体都与酶标抗原结合4/14/202345阳性对照孔4/14/2023461ng/ml标准孔=黄曲霉毒素B1分子结合到抗体上剩余的抗体再与酶标抗原结合4/14/202347阳性样品酶标抗原结合得越少，颜色越浅4/14/202348加入终止液，反应液由蓝色变成黄色，上酶标仪读取数据，画标准曲线4/14/202349调零孔阴性孔0.1ng/ml0.5ng/ml1ng/ml5ng/ml10ng/ml酶联免疫竞争法标准曲线0.1110ng/mlO.D.4/14/202350不同温度条件下的标准曲线0.1110ng/mlO.D.调零孔阴性孔0.1ng/ml0.5ng/ml1ng/ml5ng/ml10