免疫组化1-概论抗原抗体课件

免疫组化Immunohistochemistry

学习本章节的总体要求

*1.熟悉免疫组织化学技术特点及其原理

*2.掌握免疫组织化学染色的操作流程

*3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制

4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求

5.了解单克隆抗体制备原理和步骤

概论

一、什么是免疫组织化学

免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理，对细胞组织标本中的某些多肽、蛋白质等大分子物质进行定性、定位、定量研究的一门科学。免疫荧光标记抗体技术---Coons1940年

免疫酶标抗体技术---Abakane1963

不标记酶抗体（酶抗酶复合物）技术---Sternberger1970

胶体金免疫标记技术和亲和标记技术---Hsu1985

免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体。1.特异性强专一2.敏感性高检测阈值达ng或pg水平3.定位准确既可定性、定位，又可定量4.三位一体形态、功能和代谢三结合

缺点：干扰多，易出现假阳性

三、技术特点（优点）

（一）

组织处理与切片选择（二）免疫染色的前处理试剂准备（示踪，放大，标记）消化阻断*（三）免疫组化染色原理、优缺点、流程（四）免疫染色的后处理增强、衬染、封固

四、免疫组织化学染色操作步骤第一节抗原和抗体一、抗原：凡能刺激机体产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应免疫应答物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合（反应原性）的物质。抗原的免疫原性取决于抗原的①异物性；②大分子；③表面积；④专一决定簇等。

抗原决定簇(表位)：抗原分子中决定抗原特异性的活性化学基团，其性质、数量、空间构型决定抗原的特异性。---免疫组化的精确性、特异性

交叉反应：抗原（或抗体）除与其相应抗体（或抗原）特异结合外，有时可与其他抗体（或抗原）发生反应。---多数天然抗原表面带有多个相同或不同的表位---不同抗原的表位相同或相似的情况下可发生交叉反应---免疫组化的假阳性二、抗体B细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。---可与相应抗原特异性结合---亦可作为抗原，激发免疫应答

3.两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借二硫键连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体,呈“Y”字构型。4.重链上结合有不同量的糖,故Ig属糖蛋白。根据重链抗原性的不同可分为5类，即μ链，γ链，α链，δ链和ε链，由它们组成的Ig分别称为IgM，IgG，IgA，IgE和IgD。

5.轻链也可根据其化学结构和抗原性的差异分为κ和λ二型。一个Ig分子的二条轻链型别相同，绝无可能κ型和λ型共同存在于同一个Ig分子中。7.Ig的水解片断可因选用的水解酶不同而异。

采用木瓜蛋白酶(papain)水解Ig时：

---2个相同的Fab(fragmentantigenbinding)段，即抗原结合片断

---1个Fc（fragmentcrystalliable)段，即可结晶片断，拥有Ig抗原决定簇。采用胃蛋白酶（pepsin），其酶切位点在Ig重链间二硫键近羧基端---一个具双价抗体活性的F(ab’)2片断---一个不具任何免疫活性的Fc’片断。8.抗体的蛋白类型主要为IgG和IgM。---IgM见于初次免疫和免疫早期，滞留时间较短。---IgG一般见于加强免疫和免疫晚期，滞留时间较长，是免疫球蛋白的主要类型。（一）

抗原提取与纯化的一般原则1.建立检测方法（定性、定量、活性）2.选择抗原含量高、易获得、价廉、可大量收集的样品为原料---人AFP……AFP(+)肝癌病人腹水；4～6月胎儿血清---鼠AFP……孕18天大鼠羊水---波形蛋白（vimentin）……猪、牛眼晶状体---角蛋白（keratin）……角化上皮---肌红蛋白（myoglobin）……骨骼肌---胶原（collagen）……皮肤、肌腱等3.保持抗原分子的稳定性----低温、适度pH与离子强度、抑制酶解、保护巯基

4.操作步骤简易、有效。---提取---分离纯化---浓缩---贮存

（三）单克隆抗体的制备及其应用

单克隆抗体是指由单个克隆的杂交瘤细胞产生针对一种抗原决定簇的特异性抗体。它是采用B淋巴细胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。优点：纯度高、特异性强、交叉反应少、质量和效价稳定缺点：制备复杂、价格昂贵、抗体效价较低1.利用杂交瘤技术制备McAb的基本原理

---淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一个B细胞克隆只产生一种抗体；

---细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；

---利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。

2.McAb的制备流程亲本细胞准备→细胞杂交融合（PEG）→HAT选择性培养→杂交瘤细胞克隆性培养与建株（有效稀释法）→大量制备单克隆抗体→质量鉴定与分装冻存

↓（扩大培养或接种动物）（杂交瘤细胞冻存与复苏）抗原免疫免疫脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞(BALB/C小鼠) （经8-AG或6-TG诱导）(亲本细胞)

混合、融合（PEG） 选择性培养（HAT） 筛选和克隆化冻存 阳性细胞建株（稳定分泌McAb）（杂交瘤细胞）