乳制品中产细菌素乳酸菌的筛选

乳制品中具有抑菌活性的非发酵剂乳酸菌的筛选【摘要】本文对从传统农产品中分离出来的81株非发酵剂乳酸菌在以硬质乳酪为培养基的表面上生长的抑制霉菌和酵母菌的活性进行了研究。从菲达乳酪中分离出的20株兼性发酵和11株专性发酵乳酸菌都表现出了抑菌活性。对这些菌株通过表型标准水平和全细胞蛋白SDS电泳进行了物种分类。前者还表现出了广谱抗菌活性，尤其是对李斯特菌和其他食源性致病菌。细胞外抗菌物质对蛋白水解酶敏感，可以此表明其抑制物质为蛋白质。【关键词】抑菌活性；植物乳酸菌；非发酵剂乳酸菌；1概况乳酸菌历来被用作天然食品防腐剂和动物饲料，酸菜和青贮饲料。其效果主要在于形成有机酸、过氧化氢、竞争性营养产品等抗菌物质。防腐剂是指以延长保质期，由天然或增加微生物或抗菌产品而增强食品安全性。近年来，由于消费者需求的减少使用化学防腐剂，出现在食品中天然微生物的贮藏能力已经获得了越来越多的关注。霉菌和酵母菌是常见的食品（如奶酪）中的腐败微生物。苯甲酸钠和由链霉菌属产生的纳他霉素是最初是用来作为抗真菌剂的因子。然而，霉菌及酵母菌已经开始对抗生素产生抗药性，也包括山梨酸和苯甲酸。乳酸菌可产生具有抗真菌活性的化合物，如蛋白质，苯酸，环二肽，和羟基脂肪酸。乳酸菌产生的类似细菌的物质和其它中低分子量的化合物已经做为杀菌剂有了相关的报道。然而，大部分真菌对于乳酸菌代谢产物，如乳酸和乙酸的灵敏度很高，这使得乳酸菌研究变得复杂。本课题从希腊传统奶酪和酸奶中的分离出非发酵剂乳酸菌的抗真菌效果进行了研究。80株非发酵剂乳酸菌真菌的抑菌谱仍然未知，为此，通过科学分组，筛选出能产生抗菌物质的菌株，并且确定抗菌物质的性质。2材料与方法非发酵剂乳酸菌的分离这项研究中的非发酵剂乳酸菌是由传统奶酪和酸奶分离纯化而来。8株肠球菌和10株明串珠菌由Teleme羊奶奶酪中分离出。从各种奶酪中分离出来的17株副干酪乳杆菌亚种和15株德氏亚种保加利亚乳酸菌。20株从羊奶酪干腌制过程中表面生长的乳酸菌的和11株也从羊乳氨酸）的乳酸菌，分别为作为兼性和专性发酵乳酸菌进行了研究。菌株被保存于一80°C，添加甘油（70：30）的MRS肉汤培养基或M17肉汤培养基中。目标菌由4株霉菌和2株酵母菌筛选出非发酵剂乳酸菌菌株。3株霉菌（M1，M4和MT1）都由成熟Kasseri奶酪表面分离，青霉属，含有特有的抱子。青霉石斛来自维斯比（“维斯比”实验室，滕德APS，滕德DK-6270），而29株酵母菌德巴利和51株酿酒酵母菌株由羊乳酪表面获得。接种物霉菌生长在麦芽提取物琼脂斜面上，25C培养几天（直到抱子长出），收集抱子，用无菌蛋白胨水（0.2%W/V）剧烈摇动，用几层无菌湿纱布两次过滤抱子悬浮液，除去菌丝碎片。酵母细胞菌培液的制备：麦芽琼脂斜面，25C培养48小时。收集在无菌蛋白胨水（0.2%W/V）中，剧烈摇晃。霉菌抱子和酵母菌（1毫升10-1稀释液）都将用作实验接种物。2.4.抗真菌扩散法乳酸菌抗真菌活性检测采用抗真菌扩散法。将乳酸菌接种于两个2厘米线的MRS培养基上，并在30°C下培养。软麦芽提取物琼脂（7%）10毫升，含有1毫升接种的霉菌和（或）酵母提取琼脂，然后浇到琼脂平板上，并在30C培养，48小时后，测量抑菌圈。抑菌程度由抑制增长面积与培养皿的总面积的关系来计算，规则如下：一=无可见抑制；（+）=弱的抑制作用，细菌在软琼脂上生长；+=3%（板面积/细菌）没有真菌生长；++=3-8%（板面积/细菌）无霉菌生长；+++=8%（板面积/细菌）无真菌生长。2.5.兼性和专性异型发酵乳酸菌的特征表型标准的表征兼性异型发酵乳酸菌，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，应用于纤维二糖，葡萄糖，甘露醇，蜜二糖，甘露糖，棉籽糖，鼠李糖和核糖生产酸测试。专性异型发酵的乳酸菌被用于以下测试：阿拉伯糖，纤维二糖，半乳糖，甘露醇，甘露糖，蜜二糖，松三糖，棉籽糖，鼠李糖，核糖，蔗糖，木糖产酸测试。碳水化合物发酵则使用无菌多孔板和API确定。全细胞蛋白质凝胶电泳（SDS）的表征全细胞蛋白SDS电泳被用来作为一个额外的分类工具，用来区分兼性和专性的异型发酵乳酸菌的表征。全细胞蛋白分析由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）进行描述。破碎细胞中蛋白质含量的测定按洛瑞，Rosebrough，法尔，和Randall（1951）和适当的数量的SDS按照Laemmli等（1970年）来做。蛋白质电泳图谱的登记，正常化测量密度的痕迹，菌株分组皮尔逊积差相关系数（R）和UPGMA（非加权配对组使用的算术平均数的方法）分离菌株通过比较其参考菌株蛋白质图谱特征的模式进行鉴定。参考株如下，副干酪（LMG11459），Lac-tobacillusparaplantarum（LMG16673比利时根特大学微生物学实验室BCCM/LMG收集菌），植物乳酸杆菌（ATCC14917，ATCC，美国典型菌种保藏中心，洛克维尔，马里兰），戊糖乳酸菌（NCFB363;NCFB，国家食品细菌的收集，AFRC，土特食品研究机构，Reading，英格兰），鼠李糖乳杆菌（NCFB7469），短乳杆菌（DSM2647），布氏乳杆菌（DSM5987）,溶胶乳杆菌（DSM20515）和发酵乳杆菌（DSM20052，DSMZ,德国微生物收藏和德国不伦瑞克细胞培养有限责任公司）2.6抗菌活性测定抑菌谱兼性和专性异型发酵乳酸菌菌株在30C培养16小时活化，用Kekessy和Piquet（1970）的方法（可检测乳酸菌细菌素的生产）测定抑菌活性。指示菌用相应的液体培养基培养，直到600nm的光密度值为0.45。乳酸菌在MRS琼脂平板表面上的接种点接种。培养（48小时，37C）后用无菌小铲从培养皿边缘将琼脂分离，倒在皿盖上，然后覆盖在接有指示菌（稀释1%）的软琼脂上。培养，只要形成抑菌的区域，即进行测量。食源性致病菌用于测试的菌株的抗菌活性，如下：大肠杆菌0：44NCTC9702（NCTC，国家标准菌库，AFRC，英格兰），金黄色葡萄球菌NCTC9751，小肠结肠炎耶尔森氏菌0:9/4360（巴黎巴斯德研究所提供），单增李斯特菌ScottA和一株蜡状芽抱杆菌（由萨洛尼卡亚里士多德大学医学院提供）。2.7,抑菌物质对PH、蛋白酶、过氧化氢酶的敏感性八株兼性异型发酵菌株利用扩散法（罗伊，Batish，格罗弗和Neelakantan，1996年）进行实验，其抗真菌和抗菌活性一个有趣的趋势，优先抑制李斯特菌、ScottA和其他食源性致病菌。细菌发酵液提取物由MRS肉汤培养后离心获得的菌株（12000g，10分钟，4C，3K20型西格玛离心机离心）。此外，抗菌物质（AMS）样品被5N的氢氧化钠中和以排除有机酸的抑菌效果。这些经过初步处理的菌液被称为中性无细胞上清液（NCFS）。过氧化氢酶（150U/ml）被添加到已中和的样品中，以排除过氧化氢的抑菌效果。样品再次离心（12000g,10分钟，40°C）,以去除污染物。用胰蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白酶K和a-糜蛋白酶（默克公司，德国达姆施塔特）处理样品在0.2mMTris-0.5mM氯化钙缓冲液（pH值8.5）中至最终浓度为1毫克/毫升（安，斯泰尔斯，1990）。样品和未加酶的样品同时在37C下1培养小时。再用酶处理后仍然具有活性的样品，用琼脂扩散法检测抑菌活性。抗真菌活性测试以青霉M1菌株为指示菌。以5毫升含有青霉菌株M1抱子的（0.7%）软麦芽汁琼脂覆盖在平板上，在平板上打孔，在孔内加50ML样液，并于冰箱中静止2小时。然后在30C条件下培养24小时，观察抑制区的存在并测定大小。3结果与讨论3.1乳酸菌的抑菌活性对菌株的抑菌活性进行检测，penicillia，P.candidum和酵母菌D.hansenii和酿酒酵母都有着不同程度的抑菌活性，青霉M1是最敏感的指示菌。所有的分离菌株对S.cerevisiae概无抑菌活性。只有两株专性异型发酵乳酸杆菌菌株对青霉M4有抑制活性。青霉M1和MT1抑制肠球菌（分别为+++和+），肠球菌也对P.candidum和D.hansenii表现出微弱的抑菌活性。四株保加利亚菌对青霉M1有着较弱的抑制作用。12株副干酪亚种对青霉M1都有着不同程度（+至+++）的抑制。后来的菌株有5株对青霉MT1表现出了抑菌活性，9株能抑制P.candidum,有4株对D.hansenii有抑菌活性，活性范围由+到++。所有菌株的明串珠菌属抑制青霉M1（+到++），大多数都能抑制青霉MT1（+）。P.candidum和D.Hansenii分别被两株菌抑制（+）（数据未显示）。表1中体现的是兼性专性异型发酵乳酸菌菌株的抗真菌活性。兼性异型发酵所有菌株对青霉M1，P.candidum和D.hansenii显示活性（+至+++）。专性异型发酵乳酸杆菌菌株对青霉M1，M4和MT1，P.candidum和Dhansenii表现出不同程度的活动（+至++）。真菌对发酵产物乳酸和醋酸敏感（Bonestroo等，1993）。异型发酵乳酸杆菌产生大量的醋酸、乳酸和丙酸，它们的抑菌效果往往是依赖于pH值下降所造成的结果（埃克隆德，1989）。丙酸能抑制真菌生长，尤其是在较低的pH值时能抑制真菌对氨基酸的摄取（沃尔伍德，1984年）（埃克隆德，1989）。一些抗真菌的代谢产物，如肽，苯酸，蛋白质化合物和3-羟基脂肪酸已经从乳酸菌中被隔离（Schnurer，马格努松，2005年）。有抗真菌活性乳酸菌的几个报告，如okkers等（1999）发现L.戊糖乳杆菌对白色念珠菌表现出抑菌效果。lavermicocca等人（2000）报道了由酵母的植物乳杆菌生产的抗真菌化合物。同样的方法观察乳酸菌coryneformisSI3（马格努松和Schnurer2001年）以及从各种渠道分离出的植物乳杆菌coryneformis，唾液乳杆菌，乳酸杆菌，E.hirae，和肠球菌durans（马格努松，神池，鲁斯，Schnurer，2003年）。神池等（2002）也发现MiLAB393植物乳杆菌产生的抗菌物质，Addis，Fleet，Cox，Kolak和Leung（2001）报告说，在一些酵母菌与植物乳杆菌的一同生长过程的中，乳酸菌能有效的对抗酿酒酵母和其他酵母菌种。DurluOzkaya，Karabigak，Kayali，埃森（2005年）发现能够抑制酵母菌、几种念珠菌、光滑球拟酵母和深红酵母的乳酸菌，如植物乳杆菌，副干酪亚种，paracasei和乳酸菌，都是由奶酪中分离出来的。从酵母面包的几株乳酸菌对一系列的青霉菌和抗真菌活性的筛选中，副干酪亚种Tolerans抑制作用最强（哈桑和Bullerman，2008年）。此外，从食物中获得麦芽谷物时，乳酸菌消除真菌的感染的能力是最有潜力的（劳斯等，2008）。3.2兼性和专性异型发酵乳酸菌特征3.2.1.表型标准的特征抑菌谱20株兼性异型发酵乳酸菌的测试数据表明其间存在五个生化模式（表2）。5株（2032,2035,2102，2192和2193）能够从纤维二糖，葡萄糖，甘露醇，甘露糖，蜜二糖，棉子糖和核糖形成酸，被定性为植物乳杆菌（Ballows等人，1991年；Dellaglio等，1994，夏普，1979年）。六株产酸菌株（2026，2096，2114，2116，2171和2176）从纤维二糖，葡萄糖，甘露醇，甘露糖，蜜二糖和核糖产酸（2171除外），但不能从棉子糖和鼠李糖视为属L.paraplantarum（菲茨西蒙斯等，1999）。四株（2071，2101，2185和2194），可从纤维二糖，葡萄糖，甘露醇，甘露糖，蜜二糖，棉子糖，鼠李糖和核糖形成酸（其中2个），被定义到L.戊糖乳酸菌种。另外三株（2092,2093和2099），能够从以上除了棉籽以外的所有糖产生酸，被列为属L.Rhamnosus；二株（2111和Q20.3）由纤维二糖，葡萄糖，甘露醇，甘露糖和核糖生产酸，被视为属副干酪亚种（Ballows等人，1991年;Dellaglio等，1994;菲茨西蒙斯等，1999;夏普，1979年）。所有的菌株，除了两株（Q20.4及Q30.10），专性异型发酵乳酸菌是能够成长在15^的（数据未所示）。六株（R30.9,R3.2,R3.6,R3.8,Q30.1，Q30.8）能从阿拉伯糖，半乳糖，蜜二糖（50%）,核糖，木糖酸形成酸，但不能从纤维二糖，甘露醇，甘露糖（除了一个），但不能从松三糖，棉籽糖，鼠李糖和蔗糖产酸，被分类为L.乳酸短杆菌属（表2；Ballows等，1991；Dellaglio等人，1994年）。两株（Q20.4和Q30.10）能利用半乳糖，甘露糖，蜜二糖，核糖和蔗糖产酸，被视为L.fermentum。3株（W21.13,Q30.9和L30.6）能利用阿拉伯糖，半乳糖，蜜二糖，松三糖，核糖产酸，被视为属布氏菌Ballows等，1991；Dellaglio等，1994；菲茨西蒙斯等，1999）。3.2.2全细胞蛋白电泳（SDS）的特征根据SDS电泳结果（图1）,表型鉴定被证实为三种植物乳杆菌，三种paraplantarum一种副干酪亚种。一种副干酪属，一种布氏属和一种L.fermentum。重复性为92%。因此，每2到9株分8个集群进行区分。Q20.3和副干酪亚种分为第一组（平均相关性R=0.62）。第二组（平均相关R=0.80）包括四株（L.植物乳杆菌1株，Paraplantarum属1株，戊糖乳杆菌2株，L.Pentosus1株）。第三组（R=0.84）由8株组成（每一个物种都有2株，paraplantarum和rhamnosus,2株L.plantarum根据表型特征分类）还包括paraplantarum参考菌株。5株（表型鉴定的3株L.戊糖植物乳杆菌）和植物乳杆菌参考菌株为第四组（R=0.84）。第五组由一组7株（相似性为80.5%）表型鉴定为布氏（2株），短杆属（4株），L.发酵（1株），没有任何参考菌株。一株L.fermentum（D20.4）和L.fermentum参考株组成第六组（R=0.79）。L30.6，表型特征为布氏属和L.布氏参考菌株（R=0.85）并形成第七组。Q30.1（L.植物短杆菌）很独特，同样，2111和2116,表型鉴定为L.副干酪亚种。副干酪属，和Lparaplantarum形成了一个非常类似的整体轮廓，和其他不同菌株形成了第八组（R=0.94），并分别进行划定。3.3兼性的专性异型发酵乳酸菌的抗菌活性专性异型发酵乳酸菌没有显示对任何目标菌株的抑制作用。相反，兼性异型发酵乳酸菌活性有几种模式的记录（见表3）。Y.enterocolitica对任何菌都没有抑制作用。所有的菌株都能抑制干酪乳杆菌，肠球菌，乳杆菌，戊糖片球菌，单核细胞增生李斯特菌ScottA,李斯特innocua，梭菌芽抱，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的增长。此外，大多数菌株（95%）对蜡状芽抱杆菌有抑制作用。70%和75%的菌株分别为对乳杆菌亚种和嗜热链球菌有抑制作用。乳酸菌helveticus对80%菌株所形成的抑制物质敏感。重要的是，病原体（李斯特innocua除外）受到的抑制作用较强，抑菌圈比乳酸菌和梭菌（抑制区＜18毫米）大了12到70毫米不等。显示为单核细胞增生李斯特菌的被抑制的作用最强。乳酸菌是众所周知的能产生抗菌物质抑制食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌，李斯特菌，梭菌，肉毒杆菌和其他（Aslim,Yuksekbag,Sarikaya,&beyatli,2005；Psoni,Kotzamanidis,Yiangou,Tzanetakis和Litopou-lou-Tzanetaki,2007；Psoni等，2006）。Sults,梅西，邦迪，萨比亚，Battini,Manicardi（2001）发现，植物乳杆菌菌株35D对金黄色葡萄球菌及李斯特菌具有较强的抑制活性。因为乳酸菌是常用的菌，研究者们开始探讨使用乳酸菌作为细菌素生产的发酵剂（Sarantinopoulos等，2002）。值得一提的是，兼性异型发酵乳酸菌具有广谱抗菌活性和很好的抑菌效果。由Atanossova等（2003年）研究的副干酪亚种M3也是这样。因此，从这个角度来看，它们可能会被视为生物防腐剂。3.4兼性异型发酵乳酸菌的抑制代谢产物利用八个选定株上清液，用琼脂扩散法测定抑制青霉M1所表现的抑菌活性（见表4）。用过氧化氢酶处理并中和上清，降低4株