酶抑制法课件

第七章残留农药的检测方法

-酶抑制法农兽药残留检测-酶抑制法实际上，最容易引起农药食物中毒的当属有机磷类杀虫剂。我国专家江希流曾对为数众多的农药品种进行过分级排队，从中筛选出了十种强污染的农药，其中有七种为有机磷类，即敌百虫、敌敌畏、乐果、氧化乐果、对硫磷、甲基对硫磷、甲胺磷，其他三种为杀虫双、杀虫眯和除草醚。氨基甲酸酯类农药毒作用机理与有机磷农药相似，主要是抑制胆碱酯酶活性.农兽药残留检测-酶抑制法二、检测原理利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物体内乙酰胆碱酯酶（AChE）具有抑制作用的原理，在乙酰胆碱酯酶及其底物（乙酰胆碱）的共存体系中加入农产品样品提取液（样品中含有水），如果样品中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，乙酰胆碱就会被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应就会产生颜色；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的底物就不能被酶水解，从而不显色。农兽药残留检测-酶抑制法用目测颜色的变化或分光光度计测定吸光度值，计算出抑制率，就可以判断出样品中农药残留的情况。AChE属于丝氨酸为中心的酶类，羧酸酯酶（非特异性酯酶的一种）与AChE类似，同样以丝氨酸残基作为活动中心。农兽药残留检测-酶抑制法三、酶的基质和显色反应类型1.酶的基质酶抑制剂显色反应可使用的基质（底物）和显色剂很多。各种乙酰胆碱（ACh）、乙酰萘酯以及其他羧酸酯、乙酸羟基吲哚及其衍生物考虑：灵敏度，适用性，酶源、基质、显色剂获得难易农兽药残留检测-酶抑制法

1.肉眼观察法酶片法、试纸法、速测卡法基于反应体系反应前后明显的颜色变化来观察、判断农药毒性高低的一种定性测量方法。一般选用靛酚乙酸酯（红色）为底物。四、检测方法农兽药残留检测-酶抑制法原理是：胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药。美国于1985年曾报道了一种称为农药检测器的酶片，可在田间快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，其灵敏度在0.1~10mg/kg范围。农兽药残留检测-酶抑制法速测卡以滤纸作载体，白纸片上载有乙酰胆碱酯酶和基质，红纸片载有显色剂。当空白样品加于白纸片上，在酶作用下，乙酰胆碱与水发生水解，水解产物与显色剂反应产生颜色。当含有有机磷和氨基甲酸醋类农药的样品加于白纸片上时，抑制了乙酰胆碱酯酶的活性，使这种酶不能被水解，从而无显色反应。农兽药残留检测-酶抑制法白色药片变成蓝色，说明农药残留无或在检出限下；白色药片不变蓝，说明含有超出检出限的农药。农兽药残留检测-酶抑制法农药速测卡对几种常用农药的最低检测限（单位mg/kg）如下：甲胺磷1.7马拉硫磷2.0水胺硫磷3.1对硫磷1.7久效磷2.5乙酰甲胺磷3.5敌敌畏0.3乐果1.3敌百虫0.3呋喃丹0.5西维因2.5好年冬1.0农兽药残留检测-酶抑制法（1）整体测定法选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10ml纯净水或0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液〔水与菜叶的比例以(1:l)~(l:2）为宜〕，震摇50次，静置2min以上。取一片速测卡，用白色药片蘸取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。每批测定应设一个纯净水或缓冲液的空白对照卡。农兽药残留检测-酶抑制法（2）表面测定法擦去蔬菜表面泥土，滴2~3滴洗脱液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上．放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。每批测定应设一个洗脱液的空白对照卡。农兽药残留检测-酶抑制法③农药速测卡使用的最佳pH值是7.5，若样液的pH值偏离太大，会产生错误的结果。④应用农药速测卡时，反应的温度和时间对显色有影响，必须同时进行空白对照。农兽药残留检测-酶抑制法试纸法（速测卡法）操作简单、成本低，但对于深颜色样品的检测，实验误差较大，而植物酶片用于植物样品检测时也存在基体干扰问题，操作者人为因素较大，灵敏度较低，只能勉强算是一种定性方法。农兽药残留检测-酶抑制法2.比色法检测箱法、酸碱指示剂法、试剂盒法、速测灵法检测原理:利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物和昆虫的毒性作用是通过特异性抑制胆碱酯酶（ChE）来实现的，但结果的判定是根据比色管溶液的变化通过目测比色来完成的。农兽药残留检测-酶抑制法我国农业部农药检定所利用酶抑制产生的显色反应，通过分光光度计比色测定酶的抑制率，以测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量。

农兽药残留检测-酶抑制法酶抑制法只能检测对AChE具抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类农药，对其他类型农药造成的污染则无法检出，而且方法的灵敏度通常较低，如对伏杀磷、水胺硫磷、涕灭威，有时还有假阳性。农兽药残留检测-酶抑制法五、酶源种类与酶液制备1．酶源的种类酶源选择是生物酶技术应用的基础，其性质的好坏、特异性大小、稳定与否直接关系到检测的结果。各种农药对一些酶的活性均有不同程度的抑制作用。常用的酯酶：①动物（牛、猪、绵羊、猴、鼠、兔或鸡）的肝脏酯酶；②人血浆或血清；

农兽药残留检测-酶抑制法六、酶抑制技术存在的问题酶抑制法就是根据酶的活性受有机磷和氨基甲酸酯类农药的抑制而降低的原理进行检测的。酶抑制法具有操作简便、快速、不需要昂贵的仪器设备、测定方法易于掌握等优点，特别适于现场检测及大批量