-基因工程部分课件

第3章

基因工程原理

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基因工程是20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科2基因克隆操作35◆基因工程的对象是基因，所以如果是获得商品的话，就是基因的产品，或是改变了遗传性的细胞和个体。如果要获得效益的话，除了经济效益之外，还有巨大的社会效益。◆基因工程的对象是基因，而基因要安居才能乐业，也就是说基因需要在宿主细胞中工作，这样，基因工程同一般的土建工程的根本差别在于，它需要在体外操作，然后送到细胞中去进行表现。3.1基因工程的特点6

3.1.1基因工程与遗传工程遗传工程(geneticengineering)一词产生于19世纪20年代，是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想,在离体条件下,对生物细胞、细胞器、染色体或DNA分子进行按图施工的遗传操作,以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。广义的遗传工程包括传统遗传操作中的杂交技术和现代遗传操作中的基因工程和细胞工程,狭义的遗传工程仅指基因工程。7

基因工程(geneengineering)又称基因操作(genemanipulation),重组DNA(recombinantDNA)。基因工程是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因(DNA分子),按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特性,获得新品种,生产新产品,或是研究基因的结构和功能。9体外操作与细胞内表达10细胞工程(cellengineering)◆应用细胞生物学的原理和方法,结合工程学的技术手段,按照人们预先的设计,有计划地改变或创造细胞遗传性的技术,以及在体外大量培养和繁殖细胞,或获得细胞产品,或利用细胞体本身的技术领域。◆主要内容包括细胞融合、细胞拆合、染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。11

细胞分泌工程

根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或加接信号肽等措施，促进基因产物分泌的技术。13酶工程(enzymeengineering)◆又称酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性,结合现代的技术手段,在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品以及利用重组DNA技术定向改变酶,进行酶的修饰,或酶的全人工合成。◆其主要内容包括酶的化学修饰、酶的固定化、酶反应器等。14蛋白质工程(proteinengineering)◆是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作,通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术。◆主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系,利用基因工程技术,或用化学方法,合成基因,改造基因,以便合成新的蛋白质,或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。153.2基因工程技术的诞生

3.2.1基因工程的技术准备

基因工程技术的诞生不仅依赖于基因分子生物学理论的发展，同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立。最重要的技术准备是限制性酶的分离纯化、DNA连接酶的分离、大肠杆菌转化技术的突破。到1970年，这三大技术都已经建立，“万事齐备，只欠东风”了。到了1972～1973年，两位科学助产士Berg和Cohen将基因工程接到了人间。173.2.2基因工程技术的诞生18

第一个重组体的构建

1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，标志着基因工程技术的诞生。19

SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450Å的球形病毒，分子量为28×106道尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对。SV40DNA上有一个限制性内切酶EcoRⅠ的切点。21SV40病毒22◆当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。◆于是他们进行第二步的实验就是从λdvgalDNA中制备含有E.coli的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。23BoyerandCohen25◆质粒

pSC101的获得●In1972,CohenconstructedanewplasmidbeginningwithDNAisolatedfromE.coli.CohennamedtheplasmidpSC101(“SC"forStanleyCohen).Thenewplasmidhadthreeimportantfeatures:ithadonlyasinglerecognitionsitewhereEcoRIwouldcutthemolecule,thusidentifyingthespotwheretheplasmidwouldopen;

(2)ithadasequenceofnucleotidescalledanoriginofreplication,whichisneededtoinitiateDNAreplication;suchasequencestimulatesplasmidstomultiplyinahostorganism;(3)itcontainedageneforresistancetotheantibiotictetracycline;thus,bacteriahavingtheplasmidcouldresisttheeffectsoftetracycline,whereasbacterialackingtheplasmidwouldbekilledbythetetracycline.Cohen在重组DNA技术中杰出贡献26◆Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子●Tosomehistorians,thedisciplineofDNAtechnologycameintobeingoverpastramisandwichesatalocaldelicatesseninWaikikiBeach.Theyearwas1972.

●IthappenedthatHerbertBoyerwasatascientificconferenceinHawaiispeakingabouttheEcoRlrestrictionenzyme.StanleyCohenwasintheaudience.

●Afterthepresentation,CoheninvitedBoyertolunchtoexploretheirpossiblecollaborationonaseriesofexperiments.●ThetworesearcherssatandconsideredtheexperimentsthatwouldsendDNAtechnologyintoanewera.Cohen在重组DNA技术中杰出贡献29◆Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子●Cohenhadbeenconductingfruitfulexperimentswithplasmids,buthewasexperiencingdifficultycuttingopentheplasmids.●Boyer'sEcoRIenzymeseemedtobetheidealsolution,soCohensuggestedtheyjoinforces.●TheywouldusehisplasmidsandBoyer'senzymetorecombinetheplasmidDNA.■Firsttheywouldtrytorecombinetwoplasmidstoformasingleplasmid.■Ifsuccessful,theywouldattempttobringDNAfromaforeignspeciesintotheplasmidtoproducearecombinantDNAmolecule.Boyeragreed,andthebargainwasstruck.Cohen在重组DNA技术中杰出贡献30BoyerandCohen的策略31◆pSC102,体内构建的重组体●他们首先检查了EcoRⅠ对质粒pSC101和R6-5的切割情况，发现EcoRⅠ在质粒pSC101上只有一个切点，在质粒R6-5上有12个切点,这样就可以用pSC101作为重组DNA的载体分子。32

他们用EcoRⅠ处理过的和没有处理过的质粒pSC101和R6-5DNA分别转化E.coliC600,得到下表的实验结果∶

表：环状和线状质粒DNA的转化质粒DNA每μgDNA转化子四环素卡那霉素氯霉素pSC101(未切割)3×105------(EcoRⅠ切割)2.8×104------R6-5(未切割)----1.3×1041.3×104R6-5(EcoRⅠ切割)

＜51×1024×10133

◆他们从用EcoRⅠ处理的R6-5的卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并检查了它的抗性，发现该克隆同时具有磺胺的抗性，但没有氯霉素、四环素的抗性。然后从该克隆中分离了一个环状质粒DNA，命名为pSC102，分子量大约为17×106。34◆接着用EcoRⅠ分别切割pSC102和R6-5质粒DNA，进行电泳检查，发现pSC102被切成三个片段，相对于质粒R6-5的EcoRⅠ酶切片段Ⅲ、Ⅴ和Ⅷ。◆这些结果说明不同的酶切片段转化大肠杆菌后能够在细胞内进行重组连接形成有功能的重组质粒。这一结果也提示，如果能够在体外重组成功，并能将重组体引入细胞内，同样具有生物学功能。35

pSC105，体外构建的重组体◆作者为了获得体外构建的重组体，分别用EcoRⅠ切割质粒pSC101和pSC102,然后加入DNA连接酶进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上检查重组情况，同时设计一些合理的对照实验。36

质粒DNA抗生素抗性的转化频率四环素卡那霉素四环素＋卡那霉素未用酶处理2×1051×1052×102EcoRⅠ处理1.2×1041.1×1037×101EcoRⅠ+DNA连接酶1.2×1041.3×1035.7×102表：质粒pSC101和pSC102混合DNA的大肠杆菌C600的转化37pSC101与RSF1010的共整合:pSC109的构建◆象pSC101一样，质粒RSF1010上也只有一个EcoRⅠ切点，所以只要用EcoRⅠ分别处理质粒RSF1010和pSC101，然后用DNA连接酶将两个线性DNA连接起来转化大肠杆菌，得到一个具有三种抗性的重组质粒∶四环素抗性、链霉素抗性、磺胺抗性。◆这种重组说明两个复制子能够重组，并能在细胞内表达。383.2.3基因操作

的