兔出血症病毒遗传变异分析及RT-PCR检测的方法建立

兔出血症病毒遗传变异分析及RT-PCR检测的方法建立兔出血症病毒(RabbitHemorrhagicDiseaseVirus,RHDV)是一种高传染性的兔科病毒，在兔科动物中引起严重的传染病。近年来，随着病毒的逐渐变异，使得传染能力和病原性逐渐增强，RHD疫情频发，对养殖业及兔产业带来了巨大的经济损失。因此，对RHDV的变异及快速检测方法的研究变得尤为重要。本文通过对RHDV的遗传变异分析，建立适用于RHDV检测的RT-PCR方法。一、RHDV遗传变异分析RHDV病毒基因组长度约为7.5kb，分为五个开放阅读框(ORF)。通过对多个RHDV菌株的比较分析，研究发现RHDV存在较为广泛的遗传变异，其中主要集中在第三个ORF。该区域包含了衣壳蛋白VP60的编码基因，VP60是病毒的外壳蛋白，与病毒的抗原性密切相关。因此，该区域病毒的变异会对病毒的致病力以及病毒的抗原性产生影响。二、RT-PCR检测方法的建立1.试剂制备1）RHDV特异性引物和探针根据VP60基因序列设计两对PCR引物，引物一为VP60-F(5'-ATCACGATTCTGGGAAGACC-3')和VP60-R(5'-CCACTGTCTACTACCAGGTTG-3')，引物二为VP60-F(5'-GCACTGGTGACTGGGTAGAC-3')和VP60-R(5'-GCTCATGTTGGTGCTGAGTA-3')，同时设计RHDV的特异性探针VP60-P(5'-FAM-CTGTTGTACTGGTGCTGGGCCAAATGC-Tamra-3')。引物和探针的合成均由生物技术公司进行。2）其他试剂琼脂糖、Tris-HCl缓冲液、EDTA、Trizol、RNase-free水、反转录酶套装、DNA聚合酶、dNTPs混合物、MgCl2、10×PCRBuffer、TA纯化试剂盒。2.RNA提取和反转录从疑似RHDV感染兔的组织中提取RNA，一般可采用Trizol法或其他RNA提取试剂盒。依据反转录酶套装说明书进行反转录，将提取到的RNA加入反应管中，在45°C下反应需30min。3.PCR扩增PCR反应体系设置如下：10×PCRbuffer2.5μL，MgCl22.0μL，dNTPs混合物0.5μL，引物1/引物20.5μL，Taq酶0.25μL，模板cDNA2μL，ddH2O上调至总体积25μL。以下是PCR程序：95°C预变性5min95°C变性30s58°C退火30s72°C延伸20s共循环30次72°C最终延伸7min4.聚合酶链式反应产物分析将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物的大小和纯度。电泳结束后，将凝胶中的RHDV特异性条带进行切取，用TA纯化试剂盒进行纯化。5.实时荧光PCR检测按照实时PCR检测的标准操作程序进行实验。实时荧光PCR程序能同时测定多个样品，通过扩增病毒的核酸以及RHDV特异性探针的荧光信号，监控病毒含量的变化。三、实验结果1.RT-PCR扩增结果RHDV特异性引物扩增出明显的低甲基琥珀酸酯条带，条带大小约为280bp。2.实时荧光PCR检测实时荧光PCR检测结果表明，可以检测到RHDV的核酸，对RHDV菌株的检测灵敏度高，并且没有交叉反应。四、结论通过对RHDV的遗传变异分析，可了解病毒的变异情况以及变异区域。同时，建立的RT-PCR检测方法，具有