细胞生物反应器制药专家讲座

第三章细胞工程制药

—转基因动物与生物反应器细胞生物反应器制药第1页2第一节转基因动物

转基因动物是指经过试验方法，人工地把人们想要研究动物或人类基因，或者是有经济价值药品蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动物受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本身基因组整合在一起，这么外源基因能随细胞分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代一类动物。细胞生物反应器制药第2页外源目标基因制备外源目标基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择取得携有目标基因细胞选择适当体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及判定筛选所得转基因动物品系细胞生物反应器制药第3页以绿色荧光蛋白转基因小鼠为例：Geneconstruct

pEGFP-N1载体是一个把异源性蛋白质融合至EGFPN端哺乳动物表示载体，含有人类巨细胞病毒（CMV）开启子，SV40PolyA尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，含有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）抗性基因。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成表示重组体在CMV开启子开启下，表示EGFP和目标蛋白融合蛋白。波长490nm紫外线激发后，可在荧光显微镜下,观察到绿色荧光，在各种异源生物中表示且无细胞毒性。细胞生物反应器制药第4页microinjection

受精卵准备胚胎操作过程显微注射假孕母鼠准备(养母)

胚胎移植细胞生物反应器制药第5页TransgeneanalysisBiopsyPCRanalysisSouthernblot细胞生物反应器制药第6页PhenotypicanalysisPhenotypicAnalysisonfoundersharboringGFPgene(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+mice细胞生物反应器制药第7页Gurdonetal,Nature,1971,(蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA)---显微注射技术尝试Jaenisch，PNAS,1974,1976，逆转录病毒感染小鼠囊胚，使病毒DNA整合到小鼠基因组中，并传递给后代---不能广泛应用，只是少数ES细胞整合外源基因，部分组织有外源基因

Gordonetal,PNAS,1980;Brinsteretal,Cell,1981;Costantini&Lacy,Nature,1981;Wagneretal,PNAS,1981---显微注射技术建立，基因结构没有合理和认真设计，不能分析基因生理功效第一阶段：方法建立细胞生物反应器制药第8页Palmiter,Brinster,Hammeretal,1982,Nature(MT-GH)---超级小鼠其它功效基因---基础研究中一直使用Hammeretal,1985,Nature(rabbit,sheep,pig)GH为主，开始关注转基因动物病理改变第二阶段：转基因小鼠模型及快速生长家畜细胞生物反应器制药第9页TMtransgenemiceDenningetal,NatBiotech.(GT&PrP)Daietal,,NatBiotech(GT-outpig)Laietal,,Science(GT-outpig)GT:半乳糖转移酶第三阶段：异种器官移植(pig)和乳腺反应器细胞生物反应器制药第10页外源基因导入动物细胞方法：

转基因动物制备：关键技是怎样把目标基因转入动物早期胚胎细胞中原核期胚胎显微注射法反转录病毒感染法胚胎干细胞法精子载体法人工酵母染色体法受精前卵细胞显微注射法细胞生物反应器制药第11页

原核期胚胎显微注射：

创始人Jaenish（1974),主要步骤：公母畜交配（或经过人工授精）取得原核期受精卵，外源裸露DNA经过徽注射导入受精卵，然后将徽注射后受精卵移入受体输卵管中继续发育。细胞生物反应器制药第12页经过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，普通情况下5-10个，超数排卵为35个；与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵将经纯化转基因样品快速注射入受精卵中变大雄性原核内将25-40个注射了转基因受精卵移植入代孕小鼠体内；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，判定转基因整合是否及位点；子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表示2023/4/20细胞工程13细胞生物反应器制药第13页2023/4/20细胞工程141.可靠性高、重复性好2.对于小鼠来说，产生转基因动物效率比较高3.导入DNA片段大小和类型不受限制4.转基因在代与代之间传递稳定性好5.整合位点随意性可能对转基因表示造成影响6.可能会出现不希望插入突变7.开发装置和技术花费大时间长细胞生物反应器制药第14页2023/4/20细胞工程15显微注射法取得转基因鼠成活率细胞生物反应器制药第15页2023/4/20细胞工程16利用脉冲电场提升细胞膜通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞基因转移。电穿孔法实现外源基因转移细胞生物反应器制药第16页

反转录病毒感染法：

利用反转录病毒LTRs（长末端重复序列）区域含有转录开启子活性特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组，再包装成为高滴度病毒颗粒，去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，携带外源基因反转录病毒DNA能够整合到宿主染色体上。转录开启子细胞生物反应器制药第17页2023/4/20细胞工程18

缺点：低拷贝数需要逆转录病毒插入DNA大小有限可能产生不希望重组高频镶嵌现象逆转录病毒序列可能干扰转基因表示细胞生物反应器制药第18页

胚胎干细胞介导法：将目标基因转移入ES，重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因ES进行克隆，可培育转基因个体。在小鼠上应用成熟，大动物较晚。从猪胚胎中取得了干细胞克隆系1988，牛胚胎干细胞1990。建立大家畜ES细胞系仍很困难，但伴随一些相关关键技术成熟，ES细胞介导法将会在转基因动物研究中起到愈加主要作用细胞生物反应器制药第19页精子载体法

直接用精子作为外源DNA载体基因转移方法。精子直接与外源DNA混合培养，外源基因能够进入精子头部，受精后能发育成转基因动物，其整合率低（鸡为6.0%），但表示率高达50%。许多原因影响DNA与精子结合。较长DNA片段比较短DNA片段（150～750dp）更轻易被精子所摄取。对精子和附睾精子清洗可提升精子与DNA结合率。当前已采取阳离子脂质体介导法，脂质体借静电作用吸附于细胞表面，经过与细胞膜融合，细胞内吞而将结合基因导入细胞。细胞生物反应器制药第20页受精前卵细胞显微注射法

Anthony等（1999）尝试一个新方法：预先将小鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白GFP汇报分子外源DNA短时间（1min）共孵育，然后徽注射入减数分裂II期卵母细胞质中，取得64%～94%转基因表示胚胎。将转GFP胚胎移植，20%后代表现为基因整合。此项研究揭示，精子膜经冷冻干燥或解冻处理后，外源DNA可穿过外膜，吸附于内膜。因另外源DNA能经过精子徽注射有效转入卵母细胞，经膜处理携外源DNA精子徽注射是一个有效转基因伎俩。细胞生物反应器制药第21页2023/4/20细胞工程22四种方法比较方法显微注射胚胎干细胞逆转录病毒精子介导优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目标基因长度可达100Kb外源DNA整合率高；整合在生殖细胞中百分比也很高。可在整合点整合转移基因单个拷贝；该方法简单、方便缺点精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组插入突变ES细胞株不易建立，长久培养后出现分化现象；生产转基因动物都是嵌合体插入基因有大小程度；嵌合性很高；外源DNA在动物各种组织中分布不均有些结果不能重复细胞生物反应器制药第22页

酵母人工染色体(YAC)载体是近年发展起来新型载体,它能克隆百万对碱基大片段DNA。作为制作转基因动物载体含有以下优点：A.

确保大片段DNA完整性B.

提升较长外源片段在动物转基因时整合率C.

确保目标基因上下游侧翼序列完整性，因而能够消除或减弱基因整合后位置效应.所以，YAC介导法制备转基因动物含有辽阔应用前景

酵母人工染色体(YAC)法细胞生物反应器制药第23页

普通把目标片段在器官或组织中表示转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产角度考虑，生物反应器选择组织和器官要方便产物取得，比如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器研究最为引人注目。第二节动物生物反应器细胞生物反应器制药第24页※医药领域应用

a.抗出血药品

b.抗凝血药品

c.血栓治疗药品

d.肺气肿治疗药品

e.免疫治疗药品

f.人型化单克隆抗体荷兰：GenPharm企业用转基因牛生产EPO，产值40亿美元英国：生产1-抗胰蛋白酶制剂（治疗肺气肿病）转基因羊,一升羊奶6000美元1999年，只有三种产品进入临床试验；到年，已经有70各种进入临床试验或即将进入市场。细胞生物反应器制药第25页

应用转基因动物/乳腺生物反应器生产药用蛋白是药品生产一个全新模式，含有投资成本低、药品开发周期短和经济效益高等优点，将成为21世纪最含有巨额经济利润新型医药产业。

细胞生物反应器制药第26页动物乳腺生物反应器

经过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价人体药用蛋白，是研究热点。从1987年Gordon等在转基因小鼠乳汁中得到人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA），到现在已经有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表示。我国已构建了30各种乳腺特异表示载体，在表示载体构建合理性和有效性方面取得了成效。在转基因小鼠乳汁中，人血清白蛋白表示量到达3.5g/L，人凝血因子IX表示量已到达50mg/L以上，人EPO表示量到达100mg/L以上，BLG表示量到达25g/L，均属于国际领先水平。细胞生物反应器制药第27页2023/4/20细胞工程28应用重组DNA技术和转基因技术,先将外源基因置于乳腺特异性调控序列之下,再将该基因转移到尚处于原核阶段或1～2细胞受精卵动物胚胎中,经胚胎移植得到转基因乳腺表示动物个体,经过回收乳汁取得表示产物。

动物乳腺生物反应器细胞生物反应器制药第28页

表示载体构建

制备乳腺生物反应器关键是确保目标蛋白特异性在乳腺中高效表示，外源基因在乳腺表示需要有一个引导泌乳期乳蛋白基因表示序列。传统表示载体都是选取某种乳蛋白基因调控序列作为开启子元件。这些基因调控区主要包含开启子区、增强子序列和其它众多转录、翻译相关元件。细胞生物反应器制药第29页

当前用于表示载体开启子调控元件主要有四类乳腺定位表示调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BLG)，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。

2023/4/20细胞工程30细胞生物反应器制药第30页

当前已克隆并用作构建载体乳蛋白基因有：

β-乳球蛋白(BLG)基因、αSl-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白(WAP)及乳清白蛋白基因。

反刍动物普通采取牛β-乳球蛋白（BLG）基因，该基因非常稳定，并能在乳腺中特异性表示；家兔、猪和鼠类则采取乳清酸蛋白WAP

细胞生物反应器制药第31页抗凝血药品：抗凝血酶Ⅲ

第一个进入临床试验转基因蛋白产物。将半乳糖β-酪蛋白开启子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相连，转入绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊乳液中得到有生物活性抗凝血酶Ⅲ蛋白，产量可达7g/L。年6月2日上市。治疗先天性抗凝血酶缺失症病，我国年11月首次用乳腺生物反应器取得抗凝血酶Ⅲ蛋白纯品细胞生物反应器制药第32页

α1-抗胰蛋白酶:

抑制肺气肿释放蛋白酶对肺组织破坏.

是一个利用BLG基因构建重组蛋白。将BLG5末端4.0kb序列与人α1-抗胰蛋白酶（α1AT）基因6.5kb片段（去掉第一个内含子）融合，再连接羊BLG开启子，以pPOLYⅢ-Ⅰ为载体，转入羊胚胎细胞，可在转基因羊分泌乳液中得到含量高达60.0mg/ml重组蛋白α1AT。细胞生物反应器制药第33页

从转基因羊羊奶中提取出治疗心脏病药品人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA）。细胞生物反应器制药第34页红细胞生成素（EPO）

当前国内外均采取CHO细胞表示生产人EPO，成本比较昂贵，而用转基因动物生产EPO，可能是一条理想路径。将EPODNA分别以HindⅢ和BamHI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收5.4kbHinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)载体，再将867bpβ-乳球蛋白（BLG）开启子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位点，构建表示载体pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。经过显微注射方法得到转基因小鼠乳汁中EPO含量可达0.5μg/ml。细胞生物反应器制药第35页问题及展望

当前，生产实践中动物乳腺生物反应器应用已崭露头角，但这项技术还存在着众多问题，※研发周期长、前期投资大及技术难度高等，造成全部产品都未商品化；※相关转基因动物基础理论研究还比较微弱；※乳腺生物反应器异位表示和表示产物泄露问题也需要各种新技术来处理；※人们对