分离心肌细胞

急性分离大鼠心肌细胞：准备工作：a,器械：恒温水浴锅，langendorff装置，氧气，剪刀，止血钳，平镊，弯镊，眼科剪，平皿2个，500ml烧杯2个，100ml量筒1个，100ml注射器1个，1ml注射器2个，试管5-7个，吸管2个b，液体：母液，NaOH（3mol/L）,CaCl2（0.9mol/L）,葡萄糖（细胞营养），II型胶原酶，BSA（胎牛血清蛋白，心肌细胞保护作用使其不至被酶损害），KB液（细胞保存液）。2，步骤：a，打开水浴锅，调节温度到37-37.5°C，提前拿出-20°C的KB液放在水浴锅中融化。b，洗涤所有玻璃器皿，并用去离子水冲洗。c，用去离子水从上倒入冲洗langendorff装置，用注射器从装置下端打入弯管中冲洗3遍。最后用少量去离子水液封装置，避免灰尘进入。d，配制无钙液：60ml台氏母液+540ml去离子水+葡萄糖1.2g（100ml/0.2g），充氧30-50min（一般可充40min），用NaOH调节PH至7.35-7.40。e，配制有钙液：每100ml台氏液加0.2mlCaCl2，混合均匀。一般取300ml无钙液。f，酶液配制：10mgII型胶原酶+10mgBSA+50ml无钙液溶解（酶液在取挂心脏结束后，再配制，避免酶液降解；先称取的酶应放于抽屉中避光保存。）g，将有钙液用注射器从langendorff装置下端打入弯管中至上端脖颈处，注意不要有气泡，并将无钙液从装置上端倒入，打开氧气，将氧气针头插入langendorff管内。（PS：如果出现气泡反复挤压灌流装置下端胶管，将气泡挤到弯管上端）h，将针头安装在langendorff装置最下端，注意不要有气泡。（PS:可将三通装置的灌流方向堵住，轻推注射器使有钙液流出，用液体流的冲击力冲破针头安装处的表面张力，消除气泡。）i，取成年大鼠一只，雌雄不限，给一定剂量的麻药（依据体重）将大鼠麻倒。（或断髓）j，打开恒温水浴锅外循环，维持灌流液温度。k，取心脏，挂心脏（取时速度要快，避免心腔淤血，影响灌流）腱素上腔静肱梳状航.隔能.隔乳头肌主劫脉升部-肺动脆干左心耳肺动脉能右心室『左心室隔续肉柱下腔髀.豚暖索前乳头月儿后乳头肌冠状钢-F腔静脉搪-卵H窟腱素上腔静肱梳状航.隔能.隔乳头肌主劫脉升部-肺动脆干左心耳肺动脉能右心室『左心室隔续肉柱下腔髀.豚暖索前乳头月儿后乳头肌冠状钢-F腔静脉搪-卵H窟右心房前乳头肌—后乳头肌=室间隔〔肌部）（2）用止血钳夹住剑突，剪开膈，从顶部剪，暴露心脏，撕开心包膜，用弯镊将肺向下拉，带动心脏向下，注意镊子不要碰触心脏，用眼科剪将主动脉剪断，用左手轻拖住心脏，将心脏取下。（3）将心脏放入预先4°C保存的有钙液中，并置于冰上修剪心脏，有血液泵出，或肺动脉圆锥附近，即为主动脉，用镊子和剪刀将主动脉的边缘修剪平整。（PS：在修剪心脏时维持低温环境是减轻心脏跳动力，影响修剪。修剪时，不要将心脏提出液体外，避免空气进入，影响灌流。可将主动脉口用直镊夹住，然后用直剪进行修剪。）（4）将langendorff装置打开一半，注意液体流速不要太快，成股即可，用平镊和弯镊将主动脉夹住（PS：不要将主动脉夹伤），顺着液体流提升并悬挂于langendorff装置下端针头处，不要太深，最后用平镊夹住主动脉，在贴近平镊下方用线系紧主动脉。1，完全放开langendorff装置阀门，让液体以恒速流入心脏，由于流速较快，注意管上方要保持有液体，否则有大量气泡进入弯管，造成分离失败。m，一直用无钙液冲洗心脏，至心脏颜色变浅，冠脉突出，心脏停止跳动。（PS：右心房是最后停跳的。）n，用酶液进行消化，待心脏停止跳动5-8min加入酶。（PS:有争议，通常实验时心脏一停跳，就加入酶消化。但过多的钙存在时，应用胶原酶或蛋白酶会引起心肌细胞膜破裂。）o,用50ml烧杯，接取前20ml流下的液体弃去，自此后接取的消化液要循环利用，消化开始，开始计时，计滴速。p，消化过程，滴速由快变慢，由慢迅速变成滴下的液体有拉丝，心脏表面变粘（胶原等物质在消化液中存在），消化20-25min（仅做参考，冬夏季消化时间有差异），至表面韧性变低即可。t，KB液充氧后，微调PH至7.20，将KB液装入标好的离心管中，分别剪右室，室间隔，左室，剪碎组织，放入离心管中吹打，弃去组织。r，将细胞悬液放入4。。冰箱中稍静置1h。PS：消化判断终点时，可先终止灌流，剪下右室下方组织，吹散在显微镜下观察细胞活性，决定灌流是否继续。或者可先将灌流装置终止，用手慢慢轻压心脏，避免伤害心脏，将心腔中消化液挤出，观察心脏形变不恢复即可。消化不要过。有钙液和细胞悬液必须放于4C贮存待用（尤其在夏季），否则会造成细菌污染，影响实验。Tips：有钙液灌流一让心脏跳动，心腔中的血泵出；灌流时不至于淤血堵塞血管，影响灌流。无钙液灌流一将心腔中的有钙液冲洗出，使心脏停止跳动；加入的无钙液不能过多，否则细胞不耐钙，分离出的细胞抖。酶消化液灌流一消化连接心肌细胞的胶原等结缔组织，使心肌细胞分离。灌流液应始终维持氧饱和，不使心肌细胞缺氧。通常分离大鼠心肌细胞采用胶原酶，而分离豚鼠心肌细胞采用蛋白酶。用无钙液冲洗时，使心脏组织疏松，灌流滴数加快，若滴数无明显变化为灌流不完全。可用平镊夹持系线处水平旋转心脏，使灌流充分。膜片钳使用流程1，打开总稳压电源打开不间断电源，数模转换器电源打开显微镜开关4，实验准备打开电脑，放大器，进行试验实验结束后，先关闭放大器关闭电脑一显微镜一清理试验台检查三维液压是否归零，检查显微镜，检查粗调是否归中，检查氮气是否关闭清理实验室，并闭室内电源，水闸打开电脑一将桌面上clampex软件打开一File—setDateFileIndex—向上一D盘一ftm—date一点新建文件图标一修改文件名，并将下面4个数字归零一保存关闭一clampex软件左上方图标(openprotocol)—向上一D盘一ftm—protocol—#protocol#—zeropro一打开放大器一EXT.COMMAND至on—记录电流调I及V-clamp一有钙液灌流，洗细胞，压好液接电位，形成电流回路一按Q。钮(sealtest)—上电极时应注意，不要将银丝碰弯，碰断；找电极，电极入液，显示电极阻值(1-3MQ)若入液后，电极阻值达到KQ,则说明电极尖断了，应将电极出水换电极一先粗调，后微调将电极针压上细胞，电极阻值上升大约。.5MQ说明电极已压上细胞一fullscale一调转PIPETTEOFFSET钮，调基线，使电流归零一负压吸引并维持负压，阻值约20MQ时，调节钳制电位Holding-20,-40,-60mv基线平稳缓慢调节一使阻值上升至约100-120MQ时，将负压放掉使阻值继续上升，电流下降，在维持基线平稳的基础上，为保证阻值上升，给予适当的负压一直至基线归零“平”并且阻值上GQ,给予负压吸引“破”膜，并记录电流(记录中需维持负压，防止破开的膜关闭)^dit保存至新建文件夹一记录结束后需记录最大膜电容。打开放大器一EXT.COMMAND至on—记录动作电位一调V及I-clampNORMAL—记录。PS：同一细胞可记录多次，但如果每次重新破膜，需重新记录膜电容。确定细胞是否破膜：①EXT.COMMAND至OFF—调Irms一电流值在3左右，即可确定破膜一重调至I,on一记录电流。②观察电流夹角变得光滑，即可确定破膜。确定破膜后，若基线未平，说明有漏电流，需补leak一调转leak钮，补充漏电流。重新记录电流和最大膜电容。PS：放大器开关：power开，调I及V-clamp,再打开控制电钮；关，先关控制电钮，track,V-track,再关power。调节条件，在关闭控制电钮时才可进行。放大器打开后至少1h方可关闭。PS：开始试验前20min用有钙液贴槽子，恢复细胞耐钙，并使细胞贴壁，细胞不用过多；贴好槽子后，可用灌洗液(有钙液)灌洗细胞表面(速度要慢，避免贴壁细胞被吹起；灌洗装置为自制的注射器抽吸装置，每次替洗1/5浴液，清洗到视野清晰即可)，使细胞表面光滑，有利于与微电极尖端形成高阻封接；使用显微镜前先将三维液压调到1左右，并在上下0.5的范围内使用；使用显微镜找电极，先粗调，用细胞找电极，然后用微调压住细胞，开始试验。微电极的制备1,采用两步拉制法，拉制电极(垂直拉制)设定两步拉制的温度step1:72°C；step2:51.9°C。将毛细玻璃管放在拉制仪上，打到step1的温度，拉出一个7-10mm的细杆再从细杆的中间偏下部位，用step2温度，将杆拉断，拉出两根玻璃电极PS：拉制好第一步后，需等电极冷却后，拉制第二步，否则会使电极尖端变短变粗，电极阻值变大，影响实验。2，充灌电极液微电极在使用前要充灌电极液，用注射器将电极液充入玻璃微电极中，在充灌过程中，应尽量避免电极内出现气泡，如出现了可将电极尖端向下，轻敲壁除去气泡。PS：微电极应拉制的长短均匀，电极阻值相近，方便实验，一般拉制成功后，有1〜3MQ的电阻，常用于全细胞记录模式。避免碰触微电极尖端，灰尘进入堵住电极，影响试验。充灌电极液不应过多，大概1cm。充灌时首先将电极尖端浸入电极内液，利用毛细管虹吸作用使尖端部分充满液体，然后再从电极尾端充灌。在充灌中应避免电极内出现气泡，如有气泡可使电极尖端向下，轻敲管壁除去。也应避免充灌电极内液太多，否则电极内液溢出会使支持器表面变湿、形成薄膜而产生热噪声，影响实验噪声基线。用仪器记录数据在细胞进行封接以前，要用有钙液灌流复钙（约20min），使心肌恢复正常，才能记录心肌细胞中各种电位及动作电位。PH剂较正操作步骤：1，准备：（1）电极，仪表的BNC插头，连接温度传感器到HTC（2）用变压器把仪表连接到电源（3）按PH（mv）键，设置PH模式2，较正：（1）按setup，显示“clearbuffer”按Enter（2）按setup，直至显示缓冲液组“1.68,4.01,6.86,9.18,12.46”或所需的其他缓冲液组，按Enter（3）将电极清洗，擦干，浸入第一种4.01缓冲液中，等数值稳定，出现s时，按standarize，仪器自动校准，如时间较长，可按Enter手动校准，作为第一点校准，被储存显示“”。（4）清洗电极，擦干，放入6.86缓冲液中，校准方法同上，但显示“”和**%“slapexgoodelectrode”**显示测量的电极斜率，如在90-105%范围内可接受，如不，则证明与理论值有较大差异，应重新校正，显示“Err”。（5）再清洗电极，擦干，放入9.18，再进行校正，一般为3点校正。一些常用的液体成分：1，细胞外液（用于记录APD，IK^IK，Ito）母液（台母）mMmWg/Lg/500ml(x10)NaCl12658.447.363436.82KCl5.474.550.4032.015HEPES10238.32.38311.915NaH2PO4.2H2O0.33156.010.05150.2574MgCl2.6H2O1.020.330.20331.0165后加Glucose1.01.98171g/500mlCaCl21.8147.030.9mol/L每100ml无钙液中加0.2mlCaCl2（0.9mol/L：6.6g/50ml）用NaOH调PH值（7.40，一般7.35以上即可）NaOH配制：3.6gNaOH溶于30ml去离子水中2，配制KB营养液（细胞保存液）mMmWg/L(1x)g/500ml(x10)g/250L-谷氨酸70147.1375牛磺酸15125.141.8750.93750.46875KCl3074.552.2371.11850.55925HEPES10238.32.3831.19150.59575MgCl2.6H2O0.5203.30.10150.050750.025375

Glucose10198.21.9820.9910.4955EGTA0.53950.0475KH2PO410136.091.360.680.34用KOH调节PH至7.35用5mol/LKOH调节PH（28gKOH溶于100ml去离子水中）PS:先直接加固体KOH调节至7.2左右，再加液体KOH。KB液溶解缓慢，在未完全溶解前加入固体KOH有助于KB液快速溶解。溶解后4°C静置一宿，分装于用去离子水冲洗过的50ml细胞培养瓶中，并与-20C冻存。3,电极液25ml50mlKCl0.0373g0.0746gKOH0.1543g0.3086g天门冬氨酸0.3660g0.732gHEPES0.0298g0.0596gMgCl2.6H2O0.0051g0.0102gNa2ATP.H?O0.0757g0.1514g(Na2ATP.3H?O0.159852g)EGTA0.0951g0.1902g用1mol/LKOH调PH至7.20。PS：电极内液需经0.2“m的滤膜或滤纸过滤。电极液配置好后需分装于1.5mlEP管中，并-20C冻存。实验前需先解化，实验过程中应始终置于冰袋上使用。4，测IKr电流用液体：电极内液：20mlmMmWmg/200mlCsCl135168.4454.68mg(0.4547g)EGTA10380.3576.07mg(0.0761g)M