二代测序NGS培训班课件 4肖艳群-NGS实验室设置及质量控制2017.10.15福州培训班

NGS实验室设置及质量控制

上海市临床检验中心肖艳群

NGS特点应用范围广：肿瘤、遗传病、产前筛查、药物基因组学、微生物等涉及的临床科室多选择平台多流程复杂：湿实验分析过程：包括样品处理、文库构建和测序

干实验分析流程：包括序列比对、注释及变异识别商品化试剂少：大多数为LDT

如何做好质量控制，确保检测结果准确可靠？？？国家相关技术指南测序技术的个体化医学检测应用指南（试行）遗传性相关个体化医学检测应用指南（试行）肿瘤个体化治疗检测应用指南（试行）孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范

基本内容实验室设置、设施和环境质量管理体系人员设备与材料实验室信息系统分析前质量控制分析过程质量控制分析后质量控制

一、实验室设置、设施与环境要求NGS实验室资质：经批准的个体化医学检测实验室和临床基因扩增检验实验室NGS实验室设置：严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》进行设置。如果NGS项目的结果需经Sanger测序进一步验证，还需为Sanger测序流程额外设置实验区域

实验室设置要求普通PCR实验室设置原则上分为四个区：试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区如使用全自动扩增分析仪，后两区可合并如使用核酸提取、扩增和产物分析一体化的全自动分析系统，后三区可合并具体实验室分区应根据其所使用的技术平台及检验项目和工作量而定NGS实验室设置原则：工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时

普通PCR实验室

产物分析区扩增区标本制备区试剂准备区

缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区工作流向注意事项：各区有独立的缓冲区各区都有水池各区有独立的通风系统标本制备区有冲眼器和生物安全柜

产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）

测序区文库扩增标本与文试剂准备区

与检测区库制备区

缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区

工作流向

标本与文库制备区：血浆分离、DNA提取、末段修复与纯化、加“A”与纯化、接头连接与纯化文库扩增与检测区：PCR扩增与纯化、文库浓度检测、pooling、pooling后文库定量测序区：测序前准备（乳液PCR及磁珠富集）、测序上机、信息分析、报告审核及发放植入前胚胎遗传学诊断（全基因组低拷贝测序）

电泳区测序区文库检测区扩增一区WGA制备区试剂准备区

缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区

工作流向WGA制备区：全基因组扩增电泳区：DNA检测及结果反馈、DNA打断扩增一区：末端修复及纯化、加“A”与纯化、接头连接与纯化、pooling、缺口平移文库检测：测序区：扩增前准备（乳液PCR及磁珠富集）、测序仪上机数据分析、报告发放遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗

（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）

电泳区测序区文库检测区文库扩增区杂交铺获区DNA打断区标本与文试剂准备

（扩增二区（扩增一区）库制备区区

缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区标本与文库制备区：DNA提取及检测、纯化测OD、末端修复与纯化、加“A”与纯化、Adapter连接与纯化杂交捕获区：Pre-Captured-PCR与纯化

、OD值检测及pooling、杂交、洗脱与纯化文库扩增与检测区：Post-Captured-PCR与纯化、Pooling及文库定量检测测序区：测序前准备（C-Bot制备)、测序仪上机数据分析、结果解读、Sanger验证、报告发放Sanger测序验证标本与文库制备区：DNA提取与检测、目的片段PCR反应准备扩增一区：目的片段扩增与纯化、测序PCR前准备电泳区：电泳扩增二区：测序PCR扩增与纯化测序仪上机、结果分析与解读、报告发放高通量测序实验室设计注意事项电泳区：DNA提取、DNA纯化后大小检定等步骤需用电泳，单独成区，但不同的检测项目可共用测序区：应为恒温恒湿实验室，2小时内温度波动不超过2℃分区设置可根据自动化仪器设备做适当区间整合无创产前筛查实验室，因血浆提取为胎儿微量DNA，为防止污染，不能与其他项目的标本制备区共用其他：实验室通风、生物安全柜等要求参照普通PCR实验室

实验室设置、设施与环境各工作区域应有明确的标记进入和使用实验室各区域应有明确的限制和措施，防止非相关人员随意进出实验室应根据所用仪器和检测过程对环境温、湿度的要求，规定实验室温、湿度允许范围，并定期监测和记录不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染

实验室工作要求不同工作区域内的设备、物品不得混用标本处理需在生物安全柜内进行，对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖工作结束后，必须立即对工作区进行消毒。可使用可移动紫外灯在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射质量管理体系建立作用建立并保持质量管理体系有效运行的重要基础规范各项工作，保证工作质量内容：质量手册、程序文件、操作规程、记录依据：应基于相应的国家标准或国际标准质量手册程序文件操作规程记录

实验室管理文件内容1.样本的采集、运送、保存、接收、登记和处理2、知情同意告知3、检测方法和步骤4、试剂和耗材的选择和保存（如为自配试剂，需详细写明试剂的制备过程及各原料的来源）5、试剂性能验证或自配试剂的性能评价和方法确认6、仪器的使用、维护和校准7、人员培训8、结果报告与解释9、实验室数据、相关文件记录与保存10、室内质量控制11、室间质量评价或实验室间比对12、知情同意和保密程序文件编写Why：目的Where：范围Who：职责What：做什么When：何时做How：如何做注意：适合自身实际情况，可操作性

现行有效写你所做的、做你所写的、记你所做的

NGS项目SOP编写要求实验室必须为每一个NGS检测项目建立齐全和规范的SOPSOP源于一些标准文件和实验室实验工作经验的积累SOP应包括试剂准备（试剂来源及配制）、样品采集、样品接收与预处理、核酸提取、测序方法和参数、测序仪器操作、生物信息学算法/软件包和流程、结果分析和报告、实验室安全措施等

NGS项目SOP编写要求对于检测项目分析靶区域的描述（例如，多基因组合、外显子组、全基因组、染色体非整倍性等）描述检测项目可以适用的样品类型（例如外周血、血浆、FFPE石蜡标本），并指明本项目建立和验证过程中所采用的样品类型用于核酸提取和文库构建的方法和试剂用于靶区域（例如多基因组合、外显子组）捕获的方法和试剂用于湿实验分析过程的对照与设置方法所用的测序平台、测序反应的试剂或耗材的版本（例如反应池/flowcells、芯片）

测序设备上用于产生原始数据及输出格式（如fastq文件）的软件和版本号用于监控和评估测序过程的指标和质量控制参数分析流程的接受和拒绝标准（例如，如果测序覆盖度不能达到特定检测项目的最低要求，采用NGS进行靶向区域测序的结果就可能存在假阳性或假阴性，从而与后续的Sanger测序验证结果不符，因此就需要对于这类项目建立可以接受的靶向区域覆盖度标准

）NGS生物信息分析SOP编写要求详细描述NGS数据的整个生物信息分析流程输入文件、输出文件及每步分析内容每部过程中的质控条件及参数(read的质控、碱基质量、测序深度、覆盖度)数据筛选的流程及依据实验记录实验条件、步骤、计算软件试剂、引物、测序反应、平台检测的目标区域的描述（基因组、外显子、特定基因、特定panel、甲基化等）分析中用的细节（文献、网站）

记录保存与管理根据相关要求，明确各种不同测序数据的保存类型和时间一般检验报告单至少保存两年检测结果数据至少保存两年室内质控和参加室间质量评价记录和质控信息至少保存两年仪器状态和维修记录要保留到仪器使用终身测序原始图像数据可以不用长期保存，其他后续数据（例如BAM、FASTQ、VCF文件）需要保存一段时间以供后期验证时调用建议测序原始或早期的数据保存时间不少于2年对于包含序列变异信息的VCF文件和包含医学解释的正式报告，建议长期保存测序数据可以本地或云计算中心方式保存，应保证个人信息私密性和安全性

三、人员要求NGS检测实验室管理和技术人员：专业、学术水平、教育培训情况需符合要求NGS实验室技术人员：需有PCR上岗证，且应接受NGS技术的理论与实验培训，经考核合格后方可上岗NGS数据分析人员：应参与NGS数据分析培训，并考核合格后方可上岗；或已在NGS技术服务行业从事数据分析3年以上（有详细记录或证明资料）加强人员培训：制定适宜培训考核计划，每次培训有详细记录

四、设备与材料实验室必须有合适、充分、质量可靠的仪器、设备、试剂、耗材、辅助品，适用于各类型、各种工作量的需求，以保证检验质量选择测序平台需考虑的因素测序通量样品通量读段长度（读长）覆盖深度成本运行时间测序首次成功率目前主流测序平台主要性能与技术参数比较平台名称第1代

Sanger3500/3730第2代Roche454FLX系统

第2代

Roche454GSJunior第2代

HiSeq2500第2代

MiSeq第2代

IonProton第2代

IonPGM第2代

PSTAR-IIA公司

Thermo/ABIRoche/454Roche/455IlluminaIlluminaThermo/ABIThermo/ABI华因康基因

测序原理

Sanger/毛细管电泳测序

焦磷酸测序

焦磷酸测序

可逆链终止物和合成测序

可逆链终止物和合成测序

合成测序

合成测序

连接测序

检测方法

荧光/光学

光学

光学

荧光/光学

荧光/光学

检测pH值

检测pH值

荧光/光学

准确性

99.9%99%99%98%98%98%98%99%读段长度

600-1000bp230-500bp500bpRapid2x150bpHigh2x125bp2x150-2x300bp150-200bp35-400bp20-50bp单次检测通量

100-600Kb200Mb50MbRapid10-180GbHigh50Gb-1Tb300Mb-15Gb10-100Gb3Mb-2Gb1-2Gb单次运行时间

20min-3h24h24hRapid7-40hHigh<1d-6d5-55h2-4h2-8h8h优点

读段长，准确性高，易识别碱基重复区和多聚序列

读段长；比第一代的测序通量大

测序通量低，易于临床灵活设计检测项目

测序通量高，平均试剂成本低

测序通量低，易于临床灵活设计检测项目

无光学系统；成本低。1d内可完成人全基因组测序全流程。

无光学系统；成本低。可在1d内完成；通量低，适于临床检测

测序通量低，易于临床灵活设计检测项目

局限性

通量低；价格高

碱基重复区识别困难；操作复杂；仪器昂贵

碱基重复区识别困难；操作复杂；仪器昂贵

读段短；仪器昂贵，测序及数据分析时间长

读段短；仪器、试剂昂贵，测序及数据分析时间长

读段较短；碱基重复区识别困难

读段较短；碱基重复区识别困难

读段短，数据分析时间长

试剂要求实验室所使用的仪器、商品试剂、耗材、辅助品符合国家相关规定仪器：三证齐全试剂：CFDA批准（高通量测序试点单位可在限定范围内开展LDT）

仪器使用要求设备标识：唯一性标识、状态标识（正常使用、故障待修、停用报废）、校准标识（下次校准日期）设备档案：设备标识；制造商名称、型号、序列号；制造商联系人和电话；到货日期和投入运行日期；接收时状态；说明书；证实可以使用的性能记录；已执行及计划进行的维护；设备的损坏、故障、改动或维修设备检定/校准：校准参数、校准量程、校准结果评估设备使用：使用SOP、使用授权、有效性确认、人员防护、使用记录设备维护和保养：维修报告、故障修复后性能评估验证、维护周期及记录设备报废：去污染处理、保密信息去除

仪器校准要求校准程序中应有需校准的仪器、校准单位、校准周期、校准参数、校准符合要求的判断标准需对加样系统、温控系统、检测系统进行校准，有合格的校准报告（保留校准原始记录）校准的频度应参照国家计量部门或制造厂商的要求进行关注：校准参数是否齐全、校准量程是否覆盖常用检测量程、校准结果是否符合检测要求

五、实验室信息系统建立信息系统管理制度保证信息安全和完整（使用权限、维护规定、计算机安全保密和病毒防范要求，定期备份）使用计算机或自动化设备收集、处理、记录、报告、存储或检索数据时，实验室应确保做到针对每台仪器设备使用的计算机软件，制定详细的使用说明和操作流程，并验证其适用性制定并执行相应程序，保护计算机程序和代码，以保护资料的完整性，防止无意的或未经授权者访问、修改或破坏数据应维护计算机和自动化设备，确保其正常运转，并应提供相应的环境和操作条件

六、分析前质量控制ISO/IEC15189对于分析前程序的明确定义：按照时间顺序，从临床医生开出医嘱开始，到分析检验程序时终止的步骤，包括检验申请、患者的准备、原始样品的采集、运送到实验室并在实验室进行传输分析前质量管理是最易出现问题、涉及人员最多、潜在因素最多、最难控制的环节

分析前主要环节确保患者样品的采集方法正确在采集过程中确保样品和信息的完整和准确性

在检测前和检测后的样品的运输和储存过程符合规范患者样品处理（例如核酸提取）符合规范

信息采集常规信息：包括样品唯一性编号或条码、采样日期、采样时间、受检者姓名、性别、出生日期、样品来源（所采样品的组织类型）、采样单位、采样人姓名可根据检测项目制定临床信息采集表，内容包括：检测项目、样品唯一性编号或条码、受检者姓名、出生日期、年龄、民族、采样日期、样品类型、相关的临床资料（如身高、体重、疾病诊断、疾病分型分期、合并疾病、用药情况）和临检信息、采样单位及科室名称、医生姓名、送检目的等临检实验室应有专业人员根据信息采集表对检测项目的合理性进行审核，必要时可与送检医生讨论

患者的正确识别及知情同意正确识别：样品容器上应注明患者的唯一信息，通常应包括检测条码或编号、待检者的姓名、送检科室和住院号等信息患者知情同意：涉及遗传基因信息的临床检测项目，所有受检者均需签署知情同意书，告知所检测项目的目的、意义、基本过程、剩余核酸的去向及保存时间、临检样品是否可匿名用于科研项目等，确保受检者的个人隐私（包括医疗记录和医疗数据）得到保护对实施有创检查的分子诊断项目如穿刺取活检组织，采集人员应首先对检查可能遇到的风险清楚地告知患者及家属，并对紧急情况下的紧急预案如实告知，使患者及家属全面了解某些特殊检查可能带来的后果

知情同意书是医方履行如实告知义务的证据，也是患者行使选择权的书面依据

样品的采集、运送和保存用于测序样品种类包括：全血样本、血浆样本、组织标本（新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、穿刺标本）、口腔拭子和骨髓等采样临床医生需进行样品采集要求培训，确保样品采集质量，避免污染和干扰实验室应向样品采集和运输人员提出样品收集、处理、运送和保存要求

核酸提取方法及质控提取方法酚-氯仿提取法：可能导致DNA样品中酚或氯仿残留，抑制PCR反应盐析法：可能存在蛋白质及其他物质的残余，DNA的纯度和得率不高DNA提取要求在生物安全柜内进行操作DNA质控：要求OD值介于1.6-1.8之间，浓度大于50ng/μL血浆游离DNA提取：需尽可能消除血浆中各种可能抑制DNA聚合反应的抑制成分，包括血浆蛋白、血红蛋白、细胞碎片等，建议采用基于微柱吸附技术的商业化提取试剂盒。根据所需检测的项目不同，提取的游离DNA总量应为50ng-1000ng

样品保存DNA保存：纯化DNA在TEbuffer中常温下可放置26周；2-8℃冰箱中可放置至少1年；长期保存应在0℃以下如果DNA在提取后几天内用于PCR或酶切，也可用双蒸水进行溶解。建议将DNA原液保存于-70℃或以下当同一个受检者的DNA样品要进行多个检测时，建议将DNA样品分装后保存，即减少反复冻融引起的DNA降解，又可减少样品间的污染对于纯化后的血浆游离DNA，应根据实验项目对于DNA量的需求及时分装，暂时不用于检测的DNA标本应及时冻存于-80℃以下，避免反复冻融而加剧游离DNA的碎片化程度、降低后续检测的灵敏度

检测后样品的保存和处理样品在检测后要进行一定时间保留，以备必要时复查完成检测后剩余的DNA样品至少在-80℃保存2年。DNA在-70℃的环境下可保存至少7年。纯度不高的DNA样品建议保存在-20℃或更低的温度中，以确保DNA的完整性废弃的样品应作为生物危险品处置

七、分析过程质量控制检验项目开展检验方法的确认与验证质量控制程序建立

检验项目开展有明确临床需求：临床是否有需求、实验结果是否影响病人诊疗临床价值：筛选、诊断、预后判断、预测、监测、确诊等检验周期（TAT）

方法学确认CAP和ISO15189不同认可体系对方法学确认的要求共同点：新的检测方法应用到病人临床诊断前必须进行方法学确

认，以了解该检测方法的临床表现，保证实验结果可信度CAP提出了具体的要求：

实验室必须进行分析确认各项检测的性能参数，确认的参数包括：精密度、准确度、报告范围、参考区间、分析灵敏度、分析特异性等；还应确认实验覆盖的标本范围（如不同的基因型等）、标本类型（如血液、尿液、新鲜/冷冻组织、石蜡包埋组织等）

方法性能确认（与验证区别）确认（validation)验证(varification)定义通过提供客观证据证明预期的使用或应用要求已得到满足通过提供客观证据证明特定的要求已得到满足对象实验室自建检测方法（LDTs）CFDA批准试剂、检测系统（IVDs）时间1、正式开展项目之前应完成确认2、仪器或关键试剂更换、检测样品类型变

化、实验室必须重新进行性能确认1、新开项目前应完成验证2、对原有项目的仪器、试剂、方法更

新时应验证参数准确度、精密度、线性范围，参考区间，分析灵敏度（检测下限）、分析特异性（抗干扰物质），其他涉及的重要指标（标本稳定性、试剂稳定性等）

准确度、精密度、线性范围、参考区间判断标准实验室自行建立标准（可参考相关标准或文献）试剂盒或检测系统说明书提供的参数（厂商声明）如何进行方法学确认(以肿瘤NGS检测为例)肿瘤NGS性能确认参数有哪些？参数如何评价？如何对每个检测基因进行性能评价?性能确认最低应当使用多少标本？

确认参数?如何确认？平台确认确定平台鉴定一大范围基因组区域一些遗传变异的能力检测方法确认生物信息分析确认明确要求提供准确的序列数据和在靶向基因组区域内的变异

生物信息学分析独立于检测系统，先于检测方法确认，单独进行理想化生物信息分析确认利用一些包含已知变异的序列样本来验证整个数据分析流程的精确性、特异性、重复性确认的样本数量依据不同平台决定确认样本的选择可考虑一些权威的样本数据，如HapMap样本、已知遗传变异的细胞系、之前分析过的临床样本

检测方法确认精密度：每种类型的变异最少需要3个参考样品（突变百分比接近检测下限），

可同一批重复检测3次（批内），不同批间重复检测3次，在不同天，

有2名不同操作人员进行（批间）准确度：推荐使用Sanger测序法作为比较方法，突变百分比低的样本可采用其

它方法验证检测下限：可被重复检测出突变等位基因百分比的最低浓度可采用已知突变等位基因百分比的样本与另一基因组DNA混合稀释进行评价分析特异性：干扰物质报告范围：可测定的基因区域研究检测方法确认如何对每个检测基因进行性能评价可从不同的突变类型（单核苷酸变异、缺失、拷贝数变异和结构变异）和临床意义明确的常见基因如临床实验室可接受多种样本类型，对每种样本类型均需分别进行评价最低标本数：NGS检测项目、检测基因以及检测突变类型等均有不同，难以统一规定性能确认时的最低样本数。实验室可根据实际情况（检测基因数量、检测过程复杂程度等）自行确定当某个新试验通过确认，开始在临床使用——这不是确认的终点随着数据的积累及阳性样本数量的增加，可用来进行方法学的持续评估

方法学确认的持续性

质控要求编写室内质控和室间质评的操作规程，以监控和评价分析过程的质量凡出具临床检测报告的项目均应开展室内质控凡出具临床检测报告的项目均应参加室间质评或室间比对

室内质控目的监测和控制实验室常规工作的精密度，即实验室测定的批内和批间重复性IQC结果决定了实验室即时测定结果的可靠性和有效性

室内质控质控品数量：已知阴性和弱阳性质控品肿瘤NGS阴性质控品：不是指突变阴性的样本，建议采用无模板对照为阴性质控品，包含所有扩增步骤，证实样本和试剂无核酸污染阳性质控品：包括至少一个已知突变位点，最好变异百分比接近检测下限，已证实低百分比的突变可在每批次中检出质控样本无需在每批检测中包括所有突变类型，只需加入一个已知突变位点的质控品。但实验室最好有多个突变的质控品，并在日常检测中轮流使用质控样本可以采用人基因组DNA或其它合成的带有突变的基因组DNA样品检测时，需要记录和评价NGS性能检测的特征性QC参数，包括：覆盖深度、序列覆盖一致性、用于评价碱基识别和比对的质量值、等位基因百分率、链偏倚、GC偏倚以及信号密度衰减等，并且与检测验证过程中的参数进行比较对于影响临床决策的核酸变异结果，在签发报告之前，需要另外采用备选方法（如Sanger测序、SNP芯片等）对检测结果进行确证

室间质评凡出具临床检测报告的项目均应参加室间质评（已有肿瘤、产筛）室间质评样本应与临床标本同等对待及时分析室间质评反馈结果，对不合格项目，应查找原因（人员操作误差、仪器状态、试剂、调查品质量等、检测系统）采取纠正措施

监测检测结果的准确性

无室间质评项目的替代方法应定期（每年至少一次）进行实验室间比对：比对样品数量至少5份，浓度包括正常和异常水平当实验室间比对不可行或不适用时，实验室可以采用其他替代方法，如样本的盲法重检、与其他方法比较或者临床相关性的分析判断检测结果的可接受性对结果不一致的标本，应采取措施进行结果确认

八、检验后质量控制检验后过程包括系统性评审，规范格式和解释，授权发布、报告和传送结果检验结果的临床解读

检测报告检测报告基本要求：包含个人基本信息、检测结果，检测方法、检测方法局限性、本次检测关键参数（NGS的测序覆盖深度等），结果解释所参考的文献资料等信息基因的核酸信息：基因的核酸信息包括染色体基因组DNA序列和mRNA序列，核酸信息参考NCBIGenBank核酸序列数据库参考序列。基因组DNA序列GenBank注册号前面用NT、NC或AC加下划线进