葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

凝胶柱层析

分离纯化蛋白质

学习目的

了解：层析技术的基本原理;

有效分配系数Kav的计算。

理解：凝胶的选择和准备。

掌握：凝胶层析的原理和操作方法;

有效分配系数Kav的意义。

重点：

1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。

2、分配系数与被分离分子量之间的关系。蛋白质的分离纯化

蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。

凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。凝胶层析的基本原理凝胶：一些具有立体网状结构和一定孔径的高分子化合物。

分子大于凝胶孔隙范围的物质：随着溶剂在凝胶颗粒间流动分子小于凝胶孔隙范围的物质：渗入凝胶颗粒的孔隙中凝胶层析的过程凝胶层析过程的数理关系凝胶干体积Vg外水体积Vo内水体积Vi柱床体积Vt=Vg

+Vo

+Vi洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积。凝胶层析的分配系数分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被凝胶排阻的程度。Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体积Ve有关：

Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化

，分离物分子量越大Kav值越小

Kav=（Ve—Vo）/（Vt—Vo）葡聚糖凝胶柱层析法的特点天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶水的多孔网状高分子化合物。型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15

Sephadex的常见规格（分级范围）X：①交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子量产品。反之亦然。②吸水量。G-25表示：1g干胶吸水2.5mL，依次类推。葡聚糖凝胶柱层析法的特点聚丙烯酰胺葡聚糖（Sephacryl）：烯丙基葡聚糖和N,N-亚甲双丙烯酰胺的交联共聚物型号：S-100,S-200,S-300,S-400等Sephacryl的常见规格（分级范围）预装柱车间现有规格1000~100000凝胶层析的实际操作1、样品准备1.1、根据Phenyl下样合格样品的体积，加入3.5mol/L(NH4)2SO4溶液，使样品中(NH4)2SO4溶液浓度稀释到1.35~1.83mol/L。置于层析柜中10min以上。4℃，6500rpm离心30min，收集沉淀。用pH7.2士0.1的5mol/LPB溶解沉淀，完全溶解后，4℃，6500rpm离心15分钟，取上清。2、前处理2.1、0.5mol/LNaOH以22cm/h线性流速冲1.5%的柱床体积，再用注射用水冲中性3、平衡3.1先用4L200mmol/LPB以22cm/h线性流速平衡3.2再用0.05mol/LNaCl-5mmol/LPB以22cm/h线性流速平衡层析柱，不时检测出液端穿液电导和pH，如果与平衡液的电导和pH一致，表明层析柱已经平衡好。凝胶层析的实际操作4、上样上样体积不大于6%柱床体积，上样浓度控制再35mg/ml~50mg/ml，以不大于12cm/h线性流速上样。5、洗脱用0.05mol/LNaCl-5mmol/LPB溶液，以不大于12cm/h线性流速洗脱凝胶层析的操作注意事项1、盐析过程盐溶液加少，盐析程度不够；盐溶液加多，盐浓度过高有可能会导致蛋白变性；2、蛋白的上样浓度不宜过高（70mg/mlGE公司凝胶手册数据

），否则样品