遗传性疾病的分子诊断教学课程

第十五章

遗传性疾病分子诊疗

基因工程研究所南方医科大学南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第1页教学目标与要求

了解遗传性疾病分子诊疗方法学评价及产前（包含胚胎植入前）遗传缺点分子诊疗适应症。熟悉遗传性疾病分子机制及分子诊疗标准化。掌握遗传性疾病及产前（包含胚胎植入前）遗传缺点经典检测方法及临床意义。重点遗传性疾病及产前（包含胚胎植入前）遗传缺点经典检测方法及临床意义。难点遗传性疾病分子机制。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第2页本章目录第一节遗传性疾病分子诊疗策略***第二节遗传病分子诊疗第三节产前（包含胚胎植入前）遗传缺点分子诊疗****南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第3页第一节遗传性疾病分子诊疗策略*一、直接诊疗策略二、基因多态性连锁分析三、基因突变定量（dosage）诊疗南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第4页一、直接诊疗策略定义：直接检测造成遗传性疾病各种基因突变类型：点突变缺失插入倍增前提：基因已经克隆，序列和结构清楚南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第5页(一)点突变诊疗1、基因背景清楚点突变等位基因特异性寡核苷酸杂交(allelespecificoligonucleotide,ASO)PCR-ELISA等位基因特异性扩增(allelespecificamplification,ASAPCR-RFLP测序基因芯片技术等进行诊疗南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第6页2、基因背景未知点突变单链构象多态性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)异源双链分析(heteroduplexanalysis,HA)DNA序列测定蛋白截短测试（proteintruncationtest,PTT）南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第7页(二)片段性突变检测（1）少数核苷酸缺失或插入

检测点突变方法（2）大片段突变

Southern印迹技术、多重PCR技术。片段性突变是指DNA分子较大范围发生突变，碱基缺失、插入、扩增和重组。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第8页二、基因多态性连锁分析检测原理：多态性连锁分析、关联分析检测前提：致病基因还未被定位和说明基因太大突变种类太多检测方法：RFLP，VNTR，STR，SNP南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第9页三、基因突变定量诊疗检测方法：细胞分裂中期染色体检测固相杂交

PCR扩增检测内容：大范围重复、缺失南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第10页方法分辨率(碱基数)说明细胞分裂中期染色体检测染色体常规细胞培养至细胞分裂期染色；CGH5x106细胞分裂中期染色体作为探针来检测和控制不一样杂交；FISH5x104用修饰（如纤维探针）来增强分辨率；阵列CGH5x104使用阵列化细菌人工染色体载体（Bacterialartificialchromosomes，BACs）而非细胞分裂中期染色体作为探针；MAPH不确定将探针与基因组DNA杂交，然后再扩增探针；微卫星PCR1x102取决于缺失区已知微卫星；差异PCR1x102要求精心控制起始DNA质和量，结果为相对量，是一个半定量方法；竞争PCR1x102准确，结果为摩尔数，是一个绝对定量方法；Real-timePCR1x102成本较高，可有各种方法如Taqman法或分子信标法SYBRGreen染料或探针，应用越来越广泛；长片段PCR1x102检测基因内缺失比重复更有效，能够确定突变性质。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第11页第二节遗传病分子诊疗一、血红蛋白病二、血友病三、肌营养不良症四、苯丙酮尿症五、囊性纤维化六、亨廷顿病七、脆性X综合征南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第12页一、血红蛋白病血红蛋白含有4个亚基组成四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间经过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水球状蛋白。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第13页珠蛋白基因簇16p13.33-p13.11南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第14页11ｐ15.5珠蛋白基因簇:南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第15页血红蛋白类型成人Hb：Hb

A2297～98%

Hb

A2

222～3%胎儿Hb：HbF22

α2Gγ2α2Aγ2胚胎Hb：HbGowerⅠ22

ζ2Gγ2ζ2Aγ2

(妊娠12周内)HbGowerⅡ22

HbPortland22

南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第16页血红蛋白类型南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第17页血红蛋白病hemoglobinopathy

结构异常血红蛋白病

镰刀状细胞贫血；不稳定血红蛋白病血红蛋白M病氧亲和力改变地中海贫血，

珠蛋白合成降低或消失南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第18页1、镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞镰刀状贫血病—血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧功效只有正常红细胞二分之一，患者常所以缺氧窒息。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第19页N-val·his·leu·thr·pro·glu

·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)镰刀状细胞贫血分子机制

GTGCATCTGACTCCTGAGGAGGTGCATCTGACTCCTGTGGAG南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第20页分子诊疗方法限制性内切酶法（RE）ASOARMS、跨越断裂点PCR(裂口PCR、gap-PCR)南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第21页Sβ肽链Aβ肽链ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(SouthernBlot)MstII

CCTNAGG

GGANTCC1.15kb0.2kb1.35kbASSA南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第22页Sβ肽链Aβ肽链ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(PCR-RFLP)DdeI

CTNAG

GANTC268bpASSA175bp175268443南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第23页思索题（作业）书中239页中关于HbE检测请回答以下问题（1）HbE突变碱基改变情况

(2)该突变位于蛋白质第几个氨基酸（3）突变位点位于氨基酸哪一个外显子上（4）写出基因组参考序列中另外显子后内含子序列（5’和3’端各5个碱基）

(5)用MnlI酶切后，请列出各种可能情况（6）结合所学习知识，请再写出几个可能用于诊疗方法。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第24页

2.地中海贫血

因为珠蛋白链合成不平衡所造成一类常见单基因遗传性、溶血性疾病。类型：α地中海贫血，β地中海贫血，γ地中海贫血，δ地中海贫血，以这类推。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第25页地中海贫血南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第26页α地中海贫血

每条16号染色体上有两个αGene——缺失程度不一样，α链合成部分或完全受到抑制，造成不一样类型地贫。

若一条染色体上缺失一个α基因（／α－）为α+地贫，α链合成降低。若一条染色体上两个α基因均缺失（／－－）为α0地贫，α链不能合成。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第27页临床类型类型症状正常人静止型+地贫杂合子无症状轻型（标准型）0地贫杂合子轻度贫血+地贫纯合子血红蛋白H病0地贫和+地贫双重杂合子溶血性贫血HbBart’s胎儿水肿综合征0地贫纯合子胎儿水肿南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第28页胎儿水肿南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第29页α地贫分子基础

依α基因缺点程度分为：Gene缺失型（缺失1～４个α基因）非Gene缺失型（点突变）：无义突变、移码突变、终止密码突变、剪接突变等结果1

生成无功效或稳定性降低mRNA

无义突变移码突变终止密码突变起始密码突变

2

RNA加工突变

3

产生不稳定Hb南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第30页α地中海贫血分子机制南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第31页分子诊疗方法

(1)PCR法PCR法已经成为判别缺失型α地中海贫血首选方法。(2)ARMS法该法能快速判别诊疗HbCS和HbQS(3)ASA法与ARMS法相类似(4)SSCP法非缺失型α2地中海贫血突变

(5)等位基因特异性扩增技术(ASPCR）法南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第32页β地中海贫血

β珠蛋白Gene突变或缺失→β珠蛋白链合成速率下降→溶血性贫血

β0

地贫：β链完全不能合成

β+地贫：β链可部分合成南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第33页β-地中海贫血临床分类临床类型基因型基因产物临床表现重型地贫+/+、0/00/0、+/0链几乎不能合成链合成相对增加HbF和HbA2增高地中海贫血面容溶血性贫血（需输血）轻型地贫+/A、0/A0/A能合成适量链贫血不显著或轻度贫血中间型地贫+/+

链部分合成介于重型和轻型之间（不需输血）遗传性胎儿血红蛋白连续增多症缺失或突变链和链合成受抑制链合成显著增加成人HbF连续增加，无症状南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第34页患儿颅骨及面颊部骨骼增大，头颅变大，额部隆起，颧高，鼻梁塌陷，两眼距离增宽，眼睑浮肿，形成地中海贫血特殊面容。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第35页X线颅骨照片可见颅骨内外板变薄，板障增宽，在骨皮质间出现垂直短发样骨刺南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第36页-地中海贫血分子基础

地中海贫血已发觉100各种突变类型，包含点突变和基因缺失。绝大多数地中海贫血是因为基因发生点突变所致，突变包括基因内及侧翼序列。（1）编码区突变（2）非编码区突变（3）开启子区突变（4）RNA裂解信号突变（5）加帽位点单个碱基突变南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第37页☆编码区突变

——mRNA稳定性降低或形成无功效mRNA（1）无义突变密码子17：A→C

密码子43：G→Tβ0地贫（2）移码突变密码子71/72：+A

密码子41/42：－TCTTβ0地贫（3）起始密码突变

ATG→AGGβ0地贫南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第38页⑴内含子IGT→AT丧失一个剪切信号。⑵新切点产生同义突变→激活→I和Exon隐蔽裂解位点如：GGT→AGT产生新剪切点☆非编码区突变

——影响mRNA剪切、加工过程南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第39页GT→ATGGT→AGT，激活隐蔽剪切位点南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第40页☆开启子区突变

——降低mRNA转录效率-28位A→G突变破坏了TATABox。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第41页☆RNA裂解信号突变

——不能准确裂解和加polyAβ珠蛋白基因3’侧翼序列中AATAAA→AACAAA☆加帽位点单个碱基突变

——不能准确裂解和加polyA加帽位点发生A→C颠换，影响转录效率。通常是mRNA第一个核苷酸。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第42页分子诊疗方法

PCR反向点杂交(PCR-RDB)法PCR—RFLP法基因芯片法等ND1234658710911南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第43页

二、血友病

人体凝血过程需要各种凝血因子参加。因为凝血因子基因缺点而使其中某一凝血因子蛋白表示降低或缺如即造成血友病(hemophilia)。85％血友病患者是因为血浆中缺乏凝血第8因子(FⅧ)所致，约10％患者是因为缺乏凝血第9因子(FⅨ)，前者称为甲型血友病，后者称为乙型血友病。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第44页

（一）甲型血友病及其分子诊疗甲型血友病是因为凝血因子Ⅷ(FⅧ)即抗血友病球蛋白(antihemophilicglobulin,AHG)缺乏所造成凝血机制异常遗传性疾病。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第45页

2．甲型血友病分子机制

在FⅧ基因区域内，有一个A基因存在三个拷贝，其功效不详，其中一个A基因位于FⅧ基因第22号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体末端(A2、A3)。A1基因能够与其上游两个A基因拷贝中一个发生同源重组，引发FⅧ基因1-22外显子片段倒位，这种倒位造成FⅧ功效完全丧失而发生严重血友病。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第46页甲型血友病分子诊疗

（1）基因倒位检测因为50％左右甲型血友病是因为FⅧ基因中22号内含子倒位引发，所以检测该突变成为对患者进行基因诊疗首选方法。在检测基因倒位方法中首选是长距离PCR(LD-PCR)技术。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第47页(2)非基因倒位检测点突变是非基因倒位引发甲型血友病主要原因，所以对该类患者家系分析和携带者基因检测主要是经过点突变检测技术进行。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第48页1)PCR-RFLP法2)VNTR法3)STR法4)PCR-SSCP法南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第49页

（二）乙型血友病及其分子诊疗乙型血友病，又称Christmas病或血浆凝血活酶成份(plasmathromboplastincomponent,PTC)

缺乏症，是凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺点所致一个严重遗传性出血性疾病。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第50页分子机制为编码FⅨ基因缺点，造成FⅨ含量缺乏或结构异常，从而凝血功效障碍。临床表现与甲型血友病完全相同。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第51页分子诊疗直接测序法、基因芯片法和毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)；间接检测方法有：RFLP法、SSCP法、DGGE法、双脱氧指纹图谱(dideoxyfingerprint,ddF)、变性高效液相色谱法(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）

南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第52页三、肌营养不良症

肌营养不良症又称为假性肥大性肌营养不良。主要有杜氏肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)和贝氏肌营养不良症(Beckermusculardystrophy,BMD)，它们是一个常见X连锁性隐性遗传病，所以患者都为男孩。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第53页发病机制

主要为抗肌萎缩蛋白基因（dystrophingene)突变造成肌细胞膜上抗肌萎缩蛋白(dystrophin)发生结构和功效改变所致。

Dystrophin是抗肌萎缩蛋白基因(DMD基因)产物，当DMD基因突变后Dystrophin合成缺乏，该复合物无法有效形成，使细胞膜不稳定，最终造成肌细胞因通透性增加而变性或坏死，造成DMD发生。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第54页

2．杜氏和贝氏肌营养不良症分子诊疗

(1)多重PCR技术（2）短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)连锁分析（3）定量PCR技术（4）RT-PCR技术南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第55页四、苯丙酮尿症PKU是由挪威科学家Folling发觉，当初被命名为“苯丙酮尿性智力发育不全”，1937年Penrose和Quastel将之命名为苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)。其主要是因为肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase,PAH）严重缺失所致苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第56页(二)苯丙酮酸尿症分子诊疗1．PCR－STR连锁分析2．PCR-SSCP法3．PCR-RFLP4．多重ASPCR法南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第57页

五、囊性纤维化(cysticfibrosis,CF)CF是由囊性纤维化穿膜传导调整因子(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR)基因突变所致，为白种人中最常见一个家族常染色体隐性遗传性先天性致死性疾病，多累及儿童和青年，发病率以西、北欧及北美人群为高。CF常累及胃肠道和呼吸道，极易发生呼吸道感染而引发气道梗阻及呼吸功效不全，多数病人仅能成活多年到十余年。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第58页CF分子机制

CFTR基因突变已达1000余种，已知CF突变在CFTR基因中分布是非随机，绝大多数集中于编码CFTR蛋白NBFs区外显子9、10、11、12、19、20、21、22，跨膜区外显子3、4、7、14a、14b、17b以及R区第13外显子，其中除ΔF508及另外十余种较为常见突变外，其余均为罕见突变或仅见于个别病例。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第59页CF分子诊疗早期CF基因诊疗基于RFLP连锁分析，采取探针多为基因克隆过程中取得基因侧翼DNA片段。在CF基因克隆和测序以后，PCR技术被用于直接基因诊疗。同时，新突变分析方法也相继问世。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第60页

六、亨廷顿病

亨廷顿病（Huntington'sdisease,HD)是一个有IT15基因上CAG重复序列一场扩展所致常染色体显性遗传以舞蹈运动为主要特征神经退行性疾病。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第61页HD分子机制

HD即由CAG重复序列异常扩展突变引发，CAG重复范围在正常染色体为9～35个拷贝，而在HD患者染色体上，重复长度大于拷贝，CAG拷贝数目与HD发病年纪负相关，其基因突变率在人类单基因遗传性疾病中最低。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第62页HD分子诊疗

针对不一样个体利用三条引物进行PCR扩增，扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影判定IT15基因（CAG)ｎ串联重复序列拷贝数，此法能对超出95％HD患者诊疗和排除诊疗。南方医科大学遗传性疾病的分子诊断教学课程第63页

七脆性X综合征

脆性X综合征（fragileXsyndrome,FraX）是仅次于Down’s综合征又