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文档简介
课程背景1980s,转基因技术随分子克隆技术出现年,我国SFDA同意了全球第一个基因治疗药品“今又生”上市。(StateFoodandDrugAdministration)年,我国SFDA同意了全球第二种基因治疗药品HB101上市。(国家食品药品监督管理局)年12月18日出版《Science》杂志将”returnofgenetherapy”作为年度重大科学突破之一。年12月欧盟同意地全球第三种基因治疗药品上市。迄今,多达1900种基因治疗临床试验方案并正在进行临床试验。转基因技术正成为分子医学一个革命性技术伎俩,并已成为治疗许多遗传性和取得性疾病潜在希望所在。病毒转基因技术原理概述专家讲座第1页问题社会公众对健康需求增加生命科学和医学研究推进对转基因技术安全和伦理关注连续增加。病毒转基因技术原理概述专家讲座第2页课程内容分为理论课与实践课转基因技术概述病毒转基因技术原理、纯化制备技术和医学应用生物安全医学伦理问题表示外源基因复制缺点型重组腺病毒构建和判定DNA病毒RNA病毒杂合病毒病毒转基因技术原理概述专家讲座第3页第一章转基因技术概述
范雄林86-27-83650639xlfan@华中科技大学同济医学院病原生物学系硕士高水平课程——《病毒转基因技术原理》病毒转基因技术原理概述专家讲座第4页主要内容基因转移方式真核细胞转基因技术外源基因表示读框构建原理病毒转基因技术原理概述专家讲座第5页1.定义基因转移(genetransfer):
自然发生转基因技术(transgenetechnology):
人工利用病毒转基因技术原理概述专家讲座第6页2.常见基因转移方式转化(transformation)转导(transduction)转染(transfection)现象定义分类用途病毒转基因技术原理概述专家讲座第7页转化(transformation)现象:
肺炎链球菌转化试验定义:分类和应用:自然转化:感受态,宿主菌种类人工转化:低温CaCl2、电穿孔病毒转基因技术原理概述专家讲座第8页小鼠肺炎链球菌转化试验病毒转基因技术原理概述专家讲座第9页转导(transduction)现象:“U”型管试验
定义:分类和应用:普遍性转导不足转导病毒转基因技术原理概述专家讲座第10页不足转导病毒转基因技术原理概述专家讲座第11页转染(transfection)现象:
感染(infection)、病毒感染定义:广义和狭义分类和应用:物理化学方法生物学方法(病毒载体)病毒转基因技术原理概述专家讲座第12页
野生型病毒自然感染、病毒载体转染和质粒经化学法介导转染病毒转基因技术原理概述专家讲座第13页3.基因转移入真核细胞方法基因转移入真核细胞影响原因外源基因转移入真核细胞类型和方法构建外源基因基本要素
病毒转基因技术原理概述专家讲座第14页转移入原核细胞影响原因:限制-修饰系统质粒宿主范围和相容性同源重组与非同源重组基因转移入真核细胞影响原因真核与原核细胞含有显著区分;外源基因要进入真核细胞,要突破三大障碍;理想转基因技术方法病毒转基因技术原理概述专家讲座第15页质粒型载体:物理方法化学方法外源基因转移入真核细胞类型和方法传统针头注射显微注射粒子轰击电穿孔流体动力学包裹微球超声磷酸钙法脂质体法DEAE-Dxtran法病毒转基因技术原理概述专家讲座第16页惯用物理方法介导基因转移物理方法原理材料DNA用量优点缺点传统针头注射外力注射器高廉价、简单、便于应用于临床效率比较低显微注射细胞内注射DNA显微镜和显微注射针低适适用于细胞水平研究,不易降解步骤繁琐,不适适用于临床,专业技术要求高粒子轰击高压气体使微小载体加速不一样加速装置低对靶组织有很高效率需要很多设备和步骤电穿孔电脉冲电穿孔仪低高转染效率未得到广泛认可流体动力学流体动力学力量特殊注射器中等简单易于使用、转染效率高组织不足包裹微球胶囊化微球包裹DNA中等控制下投递和释放制备质量控制超声超声仪超声超声仪中等偏低安全、组织损伤小技术不停发展、经验有限病毒转基因技术原理概述专家讲座第17页外源基因转移入真核细胞类型和方法病毒颗粒型载体(病毒介导转基因技术)
假型病毒载体(复制缺点性病毒载体):含有感染性重组型病毒载体:含有感染性DNA病毒载体:AdV,AAV,HSV-1,etc.RNA病毒载体:HIV,etc.杂合型病毒载体
病毒转基因技术原理概述专家讲座第18页分类DNA病毒载体RNA病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体单纯疱疹病毒载体痘苗病毒载体杆状病毒载体鼠白血病病毒载体慢病毒载体甲病毒载体仙台病毒载体优点外源基因容量大(6-36kb);不整合到宿主染色体中,安全性高;宿主范围广泛,可感染包含分裂期和静止期细胞在内不一样类型人和各种哺乳动物细胞;易于制备和纯化,病毒滴度高达109pfu/ml外源基因可整合到人细胞基因组中实现长久稳定表示;可感染包含非分裂期细胞在内各种细胞;载体免疫原性和毒性低,无致病性,安全性好;病毒滴度高达1010pfu/ml,易于制备和纯化载体容量大(30kb~50kb),并可同时表示多基因;不能整合到细胞基因组中;宿主范围广,包含大量哺乳动物和鸟类分裂细胞和非分裂细胞,对神经系统有天然亲嗜性,并能在神经元细胞中建立长久稳定隐性感染载体容量大(25kb~40kb),并可同时表示多基因;宿主范围广,能感染几乎全部哺乳动物细胞;不会整合到宿主细胞基因组中,安全性好载体容量大(38kb),并可同时表示多基因;只能感染昆虫宿主,在人体细胞内不能复制,生物安全性高且无细胞毒性;外源蛋白表示水平高抵达细胞总蛋白50%插入外源基因容量相对较大(10kb);能够有效整合到靶细胞基因组中;感染细胞种类广泛,效率高;病毒滴度较高(106-107pfu/ml)可将外源基因有效地整合人宿主细胞染色体上;长久稳定表示;可有效地感染受精卵、神经元细胞、干细胞等各种类型细胞;对分裂期和非分裂期细胞均能感染;不易诱发宿主免疫反应不易与宿主基因组整合;宿主范围广谱,感染哺乳动物及非哺乳动物细胞系、原代细胞培养物、嗜神经元特征;机体对甲病毒载体本身免疫反应较低不会与宿主DNA发生整合,安全性高;宿主细胞广;可在各种细胞内取得较强基因表示缺点潜在产生复制能力腺病毒;缺乏靶向性;基因表示时间短;宿主对载体免疫反应较强载体容量相对较小(4.5kb);与宿主染色整合是一个随机整合仅能瞬时表示;细胞毒性免疫反应弱;病毒用量大;制备病毒滴度低表示产物纯化困难随机性整合会造成表示不确定性和潜在致瘤危险性潜在生物安全性和遗传毒性转染效率比较低、甲病毒RNA载体稳定性差、细胞毒性、仅能在体内瞬时表示包装容量小(3.4kb);细胞融合毒性;宿主对载体免疫反应较强病毒转基因技术原理概述专家讲座第19页不一样类型转基因技术方法优缺点比较转基因技术方法
优点缺点生物学方法(病毒载体介导法)转染效率高复杂生产程序适合全身应用
产品高质量控制含有靶向组织细胞能力高成本机体预存在免疫力能够干扰载体低温保留安全问题化学方法
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