优血红蛋白的提取和分离专家讲座

本课题学习目标

体验从复杂体系中提取生物大分子基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白提取中分别起到什么作用。主要原理：

①凝胶色谱法分离蛋白质原理

②电泳法分离样品原理

③缓冲溶液组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法原理和方法

4、课题难点：

①样品处理

②色谱柱填料处理和色谱柱装填。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第1页1.分离生物大分子基本思绪：

选取一定物理或化学方法分离含有不一样物理或化学性质生物大分子。2.蛋白质分离和提取原理：依据蛋白质各种特征差异，如分子形状和大小、所带电荷性质和多少、溶解度、吸附性质和对其它分子亲和力等等，能够用来分离不一样种类蛋白质。一、血红蛋白提取和分离3、提取分离方法凝胶色谱法

凝胶电泳法

优血红蛋白的提取和分离专家讲座第2页（一）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：

大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）组成多孔小球体，内部有许多贯通通道。依据被分离物质蛋白质相对分子质量大小，利用含有网状结构凝胶，来进行分离。1.概念：优血红蛋白的提取和分离专家讲座第3页3.凝胶色谱法原理①当相对分子量不一样蛋白质经过凝胶时，相对分子量较小蛋白质轻易进入凝胶内部通道，旅程较长，移动速度较慢;②相对分子量较大蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，旅程较短，移动速度较快。③依据特征是：蛋白质分子量大小。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第4页4.凝胶色谱法分离蛋白质原理和详细过程优血红蛋白的提取和分离专家讲座第5页凝胶色谱法分离蛋白质过程动画演示

优血红蛋白的提取和分离专家讲座第6页（二）缓冲溶液

1.概念:在一定范围内，凡是能够抵制外加少许强酸或强碱影响使原来溶液PH值基本保持不变混合溶液。

能够抵制外界酸和碱对溶液PH值影响，维持PH基本不变。2.作用:思索：说出人体血液中缓冲对。

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3优血红蛋白的提取和分离专家讲座第7页通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调整缓冲剂使用百分比就能够制得在不一样PH范围内使用缓冲液。

4.提问：在本课题中使用缓冲液是:__________,利用缓冲液模拟细胞内PH环境，确保

血红蛋白正常结构和功效，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液3.缓冲溶液配制:其目标是:优血红蛋白的提取和分离专家讲座第8页（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移过程。2.原理：①许多主要生物大分子，如多肽、核酸等都含有可解离基团，在一定PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极移动。③分离样品中各种分子带电性质差异以及分子本身大小，形状不一样，使带电分子产生不一样迁移速度，从而实现样品中各种分子分离。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第9页影响蛋白质分子运动速度原因

决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第10页

在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图优血红蛋白的提取和分离专家讲座第11页

聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、测定蛋白质分子量:惯用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂作用下聚合交联成含有三维网状结构凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联共聚反应优血红蛋白的提取和分离专家讲座第12页

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率取决于它所带净电荷多少以及分子大小等原因。2.原理：

SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链，所以测定结果只是单条肽链分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷量大大超出了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不一样种蛋白质间电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子大小。3.SDS作用机理:优血红蛋白的提取和分离专家讲座第13页用SDS测定蛋白质分子量方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，可选取一组已知分子量标准蛋白同时进行电泳，依据已知分子量标准蛋白电泳区带位置，能够测定未知蛋白质分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量标准蛋白试剂出售。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第14页

二、试验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度判定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程可选取猪、牛、羊或其它脊椎动物血液来分离血红蛋白。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第15页血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团2.提问：血液有哪些成份？

1.提问：用鸡红细胞提取DNA，用猪、牛、羊红细胞提取血红蛋白原因是什么？

鸡红细胞含有细胞核，含有DNA，便于进行DNA提取；人红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第16页血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链围绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子O2或一分子CO2，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白特点：优血红蛋白的提取和分离专家讲座第17页(1)红细胞洗涤:去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白分离纯化.1、采集血样2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果）3、吸收血浆：上层透明黄色血浆。4、盐水洗涤：下层暗红色红细胞+五倍体积0.9％

NaCl溶液洗涤，搅拌10min5、低速短时间离心：6、重复3、4、5步骤三次上清液中已没有黄色：红细胞洗涤洁净。①目标:②操作：洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第18页(2)血红蛋白释放：加蒸馏水到原血液体积，加40％体积甲苯

（溶解细胞膜）置于磁力搅拌器搅拌10min（加速细胞破裂）红细胞破裂，释放出血红蛋白优血红蛋白的提取和分离专家讲座第19页(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以r/min速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，分液漏斗中静置：分出下层红色透明液体。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第20页甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次优血红蛋白的提取和分离专家讲座第21页(4)透析：①过程：取1ml血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml20mmol/l磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h②目标：除去样品中分子量较小杂质和离子。或用于更换样品缓冲液。20mmol/L磷酸缓冲液1mL优血红蛋白的提取和分离专家讲座第22页透析过程动画演示优血红蛋白的提取和分离专家讲座第23页2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱制作：①取长40厘米，内径1.6厘米玻璃管，两端磨平。②底塞制作：

打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管一端。注意事项：玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然难以铺实尼龙网，还会造成液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按对应位置组装成一个整体。⑤安装其它从属结构。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第24页（2）凝胶色谱柱装填①凝胶选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

优血红蛋白的提取和分离专家讲座第25页③凝胶色谱柱装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性迟缓倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀注意：1、装填时尽可能紧密：降低凝胶颗粒之间空隙。

2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第26页

④洗涤平衡：连接缓冲液洗脱瓶，在50cm高操作压下，用300ml20mmol/L磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12h。注意：1、液面不要低于凝胶表面，不然可能有气泡混入，影响分离效果2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒现象。（2）凝胶色谱柱装填50cm高优血红蛋白的提取和分离专家讲座第27页（3）样品加入与洗脱①调整缓冲液面：打开下端出口，使缓冲液下降到与凝胶面平齐，关闭出口②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱顶端，注意：1、不要触及并破坏凝胶面。

2、贴壁加样

3、吸管管口贴着管壁围绕移动加样③样品渗透凝胶床：打开下端出口，使样品渗透凝胶床内，样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口④洗脱：加入pH=7.020mmol/l磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤搜集：待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每5ml搜集一试管，连续搜集。（假如红色区带均匀一致移动，说明色谱柱制作成功）优血红蛋白的提取和分离专家讲座第28页（3）样品加入与洗脱注意：正确加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第29页思索下面问题：让血红蛋白处于稳定pH范围内，维持结构和功效正常。

1、在血红蛋白纯化整个过程中不停用磷酸缓冲液处理目标是什么？

2、与其它蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，所以在凝胶色谱分离时能够经过观察颜色来判断什么时候应该搜集洗脱液。这使血红蛋白分离过程非常直观，大大简化了试验操作。优血红蛋白的提取和分离专家讲座第30页

血红蛋白提取和分离程序包含：样品处理、粗分离、纯化和纯度判定。样品处理：经过洗涤红细胞、血红蛋白释放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，样品粗分离:透析→去除分子量较小杂质样品纯化：凝胶色谱法→除去相对分子质量较大

杂质蛋白纯度判定:聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度判定。3、你能描述血红蛋白分离完整过程吗？优血红蛋白的提取和分离专家讲座第31页（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2.试剂