单克隆抗体的制备专家讲座

丁乔棋

年8月9号单克隆抗体制备

Monocolonalantibody

单克隆抗体的制备专家讲座第1页什么是单克隆抗体？1、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：

由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同细胞群，这一细胞群所产生化学性质单一、特异性强抗体称为单克隆抗体。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能连续地无限量供给。单克隆抗体的制备专家讲座第2页单克隆抗体制备原理

-----单克隆抗体的制备专家讲座第3页单克隆抗体杂交瘤技术基本流程

单克隆抗体的制备专家讲座第4页

在培养基中加入氨基嘌呤，搜集增殖细胞！3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞③瘤-瘤融合细胞未融合细胞：④单个B细胞、⑤单个骨髓瘤细胞这五种细胞中，

①④没有分裂能力，逐步衰老死亡；③⑤DNA复制只有D路径，

加入氨基嘌呤后，使D合成路径阻断，也逐步衰老死亡，但②DNA复制有D、S两条路径，即使D路径被氨基嘌呤阻断，不过还能够经过

S路径进行DNA复制，使细胞有分裂能力。单克隆抗体的制备专家讲座第5页单克隆抗体的制备专家讲座第6页单克隆抗体制备步骤

一：免疫原制备：1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质2：半抗原：多糖、药品、激素、肽类等分子量小于5000Da物质3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用高效价抗体单克隆抗体的制备专家讲座第7页

单克隆抗体制备步骤

免疫动物选取：6-8周龄雌性，纯系BalB/C。免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周

100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。

免疫程序：免疫剂量、免疫路径、免疫次数、

间隔时间、佐剂选择。二.动物免疫单克隆抗体的制备专家讲座第8页单克隆抗体制备步骤

抗原接种单克隆抗体的制备专家讲座第9页

单克隆抗体制备步骤

三：细胞融合

细胞融合基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG

融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到杂交瘤

细胞继承了B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代特征,并以此进行

大规模细胞培养,生产出大量特异性良好单克隆抗体,为快速诊疗试剂研制

奠定了坚实基础。

单克隆抗体的制备专家讲座第10页所需试剂：

培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液细胞融合剂：PEG:分子量4000PEG是最惯用细胞融合剂

作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而

有利于细胞融合作用特点：随机发生，不一样厂商、批号、分子量PEG，其纯度

与毒性有所不一样单克隆抗体的制备专家讲座第11页

单克隆抗体制备步骤

三.细胞融合

步骤培养骨髓瘤细胞1：选择对数生长期的细胞进行传代培养。2：胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐3：避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞饲养细胞的制备2：固定小鼠，切开皮肤，夹起腹膜。3：往小鼠腹腔注射适量不完全培养液:，吹打几次。4：抽出腹腔培养液，加入一定量的不完全培养液，加入血清，使血清浓度为20%。5：分装至96孔板，co2培养箱培养。脾细胞的制备1：取已免疫小鼠，眼球采血，分离血清作对照血清。2：拉颈处死，泡于75%酒精中。3：开腹取脾4：在不完全DM液中碾磨脾脏至粘稠5：收集脾细胞，离心。●·1：喂养细胞为小鼠腹腔巨噬细胞。单克隆抗体的制备专家讲座第12页

单克隆抗体制备步骤

1：将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀2：离心，弃上清，磨成糊状3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG14504：加入DM液5：离心，弃上清6：HAT重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱7：五天后，15%血清HAT补液8：八天后，彻底换15%血清DM液三.细胞融合单克隆抗体的制备专家讲座第13页ELISA方法筛选阳性孔单克隆抗体制备步骤四.杂交瘤细胞及阳性孔筛选单克隆抗体的制备专家讲座第14页阳性孔单克隆抗体制备步骤

用多孔细胞培养板培养，稀释度要确保每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应四.杂交瘤细胞及阳性孔筛选间接ELISA方法筛选阳性孔单克隆抗体的制备专家讲座第15页单克隆抗体制备步骤六：亚克隆是为了取得稳定阳性菌株对检测有阳性且敏感性好细胞要尽早进行克隆化,不然抗体分泌细胞会被抗体非分泌细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞生长速度比抗体分泌细胞生长速度快,二者竞争会使产单抗细胞丢失单克隆抗体的制备专家讲座第16页单克隆抗体制备步骤筛选阳性细胞孔HAT重悬阳性孔内细胞取10ul做倍比稀释目标孔：80-100个细胞将目标孔细胞全部移至适量HAT溶液中，铺板每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔按上述方法进行第二，第三次亚克隆第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔细胞进行扩大培养六：亚克隆每次亚克隆后要进行细胞冻存保种单克隆抗体的制备专家讲座第17页单克隆抗体制备步骤1：在建立杂交瘤细胞过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对全部杂交瘤细胞作深入工作，需要把其中一部分细

胞冻存起来；另首先，为了预防试验室可能发生意外事故。2:配制方案：DMEM:血清：DMSO=7：2：1“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

保留多年至数十年.

“快融”：取出马上浸入37℃～40℃水浴中，使其快速融化、复苏.七：杂交瘤细胞冻存与复苏细胞冷冻意义预防污染、

防止染色体丢失、预防非分泌细胞过分生长、预防细胞密度过高而死亡单克隆抗体的制备专家讲座第18页单克隆抗体制备步骤八：怎样得到大量单克隆抗体？动物体内诱生法：使用动物当然首选BALB/c小鼠,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量腹水单抗且抗体浓度很高。体外培养法：a、悬浮培养法b、微载体培养法Microcarrierc、中空纤维细胞培养系统d、微囊化细胞培养系统

单克隆抗体的制备专家讲座第19页搜集细胞培养瓶中杂交瘤细胞以备注入小鼠腹腔诱生腹水时,一定要用无血清培养液多离心几次,将细胞培养液含有牛血清洗净,预防牛血清进入了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠选择上一定要选择活力好、腹腔大小鼠。当小鼠腹腔开始发胀后,天天亲密关注小鼠状态,取出腹水,马上离心,去除上层腹腔脂肪,下层有时会出现细胞,除去。离心后马上进行纯化。单克隆抗体的制备专家讲座第20页单克隆抗体制备步骤饱和硫酸铵一DEAE离子交换柱法离子交换是指液相中离子与固定相上可解离基团可逆交换反应。利用这个反应先将要分离混合物在一定pH溶液中解离,而后流经固定相,使之与固定相上可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上,凡不能进行交换吸附成份,则流出层析柱外。当pH一7.4时,IgG所带电荷为零,最先流出柱子。过柱前先用饱和硫酸铵法初步提纯。蛋白质在不一样浓度盐溶液中相对溶解度不一样,血清丫球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀,而白蛋白则不易沉淀,据此可将二者分离辛酸一饱和硫酸铵法_在酸性条件不(pH4.5),非lgG蛋白成份(包含白蛋白,部分免疫球蛋白),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩下蛋白主要为IgG,再用硫酸钱沉淀上清,即可取得纯度较高IgG。九：单克隆抗体纯化单克隆抗体的制备专家讲座第21页单克隆抗体判定单克隆抗体纯度判定:用SDS一PAGE电泳判定纯度单克隆抗体敏感性(IC50)值测定:间接竞争ELISA试验中,普通是经过IC50值来判断抗体对CAP敏感性,故用7个不一样偶联比HAP一OVA进行ELISA试验,测定不一样偶联比包被抗原对应IC50值。单克隆抗体特异性测定(交叉反应)做间接竞争ELIsA,计算各自ICS。值,计算交叉反应率。假如含有与待测物相同结构或部分相同结构物质存在交叉反应,将测定结果升高,造成假阳性,普通以交叉反应率表示,交叉反应率越小,说明抗体特异性越好。单克隆抗体的制备专家讲座第22页7.单克隆抗体亚类判定和腹水效价测定

将单抗腹水与Sigma企业标准抗BALB/C小鼠IgA,IgG1,IgG2a,IgG