又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系

多重PCR（multiplexPCR）,又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.DNA引物引物的选择遵从简单的规则：引物长度为18-24bp或更长，GC含量为35%-60%,退火温度55°C-58C或更高。长些的引物（如DMD基因的引物，28-30bp）使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特异性产物。使用软件Primers1.29（从/下载的免费软件）来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。使用BLAST工具在NCBI序列数据库中对多对引物进行比对，以检测可能的重复序列。单基因的PCR.首先设计了一个分别单独扩增所有基因的PCR程序。反应混合物包括：1xPCR缓冲液，0.4gM引物，5%DMSO和1UTaqDNA聚合酶，共25gL反应体积。将在同一台PCR仪，在同型号的不同PCR仪上，在不同型号PCR仪上及在不同制造商的PCR仪上进行的扩增反应结果进行比较。在同一台PCR仪上或在同型号的不同PCR仪上扩增，实验的重复性很好，但在不同制造商的PCR仪上进行的扩增反应结果有明显差异，但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。实验表明对于100-300bp的基因扩增产物，通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。对于单一PCR反应，退火时间与延伸时间并不明显影响结果，但改变退火温度可以改变PCR产物的特异性和产量。对于扩增22Y特异基因（Figure2a），PCR程序A得到最佳结果（Table2）。ILL醐rtfprimtrxIH-dlnthrMUHpki林幄fmHNam*恤Lffi)S^u际N寸m导<Eocjus)Sf»(bp)(g时t叩）Nairn<IOCJUB>SizeY-1Y-EY-3Y-4泗4SY1433-113蹈aT14472D7S273DYS231DYS1JSSRY301SY15-?涎sY10G3013C3DY5Z24□YSMO口丫别DYS2BOSY1T7262sY81?ogsYB2264SY127274心潴DVS271DVK7SW地怕武海浏玫1快谱Y-6HP3E舔獭KA1YDYS274DVF43S1sVI&t183«¥147100Y6PHc&41CBs¥1^9T32KALfDVS232na.DZS115Dh¥153133DYS275DY^2J7sraa123sY97104DYS27EDY■里网HMDebfiSi眼□MDfxo-nSizeKIflM：&Si*No.Cbp)(rocus)(bp]iz.1No.45547Ft1535AFU263;d1Dl2SSt3231.7-541PME35No.3AFU2&E^DT2S43271-231No.19459No.5C271AFIJ2&hxg3P13S310243^25?No.174UNa.6AFMiilYvb&D12S&522fl-?3CPdo.S1明8N9,p睥qUd.12331Nq.44-绝&No.fl19Gna_-IoclieiislssignHiPM-promalarF&g-ionNo.601驷AFUZWzeiD心MAPLf?99zd$□125349AFM135x&3DIW孙7AfW蹿讯胳D12S8£183-?01佛睥142-1fi8105-126I-§0多重PCR多重PCR:等物质量的引物混合物（步骤4）.将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化（Table1和Figure2b）。初次进行多重反应时，各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。结果将会揭示哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变。下面将解释并讨论一些优化的例子，由于许多参数被提及不止一次，因此这些例子并未严格遵照Figure1中所列的步骤。

TtMeZ.C)clln(CoBilltlon^FC'RPr理ruimProgramAPr-ogramBProgramCFtrstDenaturing94C,4mtn94G4min94C,4minDfwIu咫&4C,30s94C.加94C,-305Anilol&4-5&C,30矿54C,1Min54C,45sExtend65C,1minT2°Cr1min,20s6&X.2mm32cycles32cycles32cyclesFhfkal£j(teri&iori65C,3irm72C3min6&C,-3rtih、ProgramDProgramEProgramFFirstDenalurirtg94C,4min94'C,4minnc>neDenature54C.3CsWCJOsMC.30-45sAnn^at55C,30s54C.45&W-58C,车队Extend65C,Ahrtirt65C,2min&8C,2m岫30a32cycles45cycles35cyclesFinalExtension65C,3min65C,5minnoneBoldcharactensshowmosttmportantmodifications\vtienprogramsarecompared.*Pr令9「沙〕Awitht缶中different&nnsoling1自mp^wlure^atcordiing1othe-typeofPCRamplification[seeResultsandDiscussion'i.J海亨猬FigureL(a}Singl-e-kaeusPC'll.ArnpiiVrAtjoncfttiflsY心iuWngt-PCRbufteranidprugminA.OriheBjet,tbepnwlLifftsarearrangedinuicreusingorderofs^rnumber:1—3Y]4.2-^¥B!.J-sY82.4--s¥B4.5-ff¥^6^-3¥S8h7-sY94,S-s¥?5.9-ff¥97,IQ-sYl-OU.IL-EYIO5.口・&丫1睥，]3-sYI17hM-t¥]2J.I5-5Y13J.(6"*YI4.\l7-!>n-47LIBrYIJ%|9-(¥l2J-5Y157and22-iYlS2).AllprodLictsJiadtheexpectedandtheremisnovisiblenilspecificHinpliticaliDn.LnallIsjihwithoutsk&elBhffii-thesi»nurlceri]-fcbI:LifeTstinol雌谷).fb)OptionizedmuLbp]esre^Gfions.\rulLipk«iPCRwilhpritnermwliirBY-lftYM.(YLM.iYI]7,iY102.(YtSlhnlWnnd(YBS).Y^214^tHE57,lYrfl,sY!1U±ndsV147)TV^l怛¥食％sVLUJriYM,VftHPJJ；.¥6Ptic54riVl紧冲』(sYI4.i¥95.eY127.SYL0*?卵应inI.&*PCRbuffedPCRprotramEj.Mix¥-?*i&rniKtui'?Y-JwilMnprimersY61^1FJSnndYtFhc^4.Arrawdi^idkntetlieffiipejctedam.plhonproi(c)以眦篮buheiupri制m巳MulDplcxPtftwithniiiturfii¥■I始Y-4with.PCftpnogrunuAliiiiJUiTihLfi2'j.AlIaiiiplipreducareiuiirIsiustextmLionit65t'J.InliieL醐LlourhneBfexlDnsiorsi72C).bardsaremissiiifinY-1and¥-2.andunspecificpradudisappearinY-]mdY'S*,Lengthmark^iniilJfigyre?-I-kbladder.Inall；xjvsIr^mi廿bottomiSllLs.j*JCe|!1.犯.j多重PCR反应循环条件的优化编辑本段回目录延伸温度.Figure2c展示了当加入相等量(0.4JMeach)的四种用于扩增Y染色体上不同基因的引物进行多重PCR时，用程序A和程序B扩增得到的结果(Table2)，程序B有更高的延伸温度(72°C)和更长的退火和延伸时间。总的来说，用程序A对Y-1,Y-3*和Y-4的扩增得到了更高产量的PCR产物。此外，用程序B扩增时某些产物消失(Y-1、Y-2)，同时出现了某些非特异性的扩增产物(Y-1、Y-3*)。程序B得到的结果更差一些，表明高的延伸温度减少了某些基因的扩增，尽管我们试图用长的退火时间和延伸时间来消除这种影响。延伸时间.在多重PCR中，由于同时扩增多个基因，酶和dNTP的缺乏就成为限制因素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。两个实验表明了延伸时间的影响。在一个实验中，一对Y染色体引物(Y6BaH34pr,910bp)被加入X染色体引物混合物(X-3)中。结果表明(Figure3b)，多重PCR中增加延伸时间(程序A与程序D)可以增加较长的PCR产物的产量。在另一个实验中，用程序C和A(Figure3a和Table2)扩增四个Y染色体上的基因。当延长延伸时间时，所有基因的PCR产物量都增加了。退火时间和退火温度.将退火时间从20秒改为两分钟并未改变扩增效率，但退火温度却是最重要的参

数之一。尽管许多基因能在退火温度为56°C-60°C被特异的扩增，我们的经验表明将退火温度降低4C-6C对于在多重PCR中扩增出同样的基因是必需的。Figure3,d-f展示了这种情况，单独扩增时退火温度为60C的基因在多重PCR中退火温度为54C时最优。尽管在54C时可能出现非特异性扩增(如Figure3c)，但多重反应中并发的其他基因的特异扩增会消除非特异性扩增的影响。相似的，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。这是由于在PCR反应中酶和dNTP的供应是有限的，所有的产物都是由同样的一组原料生成。PCR循环数.引物混合物Y-3*被用于扩增两个不同的基因组DNA样品，以不同的循环次数做多次实验(Figure4a)。其中的一个基因组模板质量更高或DNA含量更高。可以看出，当循环数增加时，两组样品的各扩增带的产量都逐渐增加。PCR产物量增加最明显是在25个循环附近。通常对于一个反应，28至30个循环足矣，增加至60个循环对产物量无明显影响。多重反应中试剂组分的优化编辑本段回目录当使用同样的扩增程序时，不同的实验间存在差异(Figures2c和3a)。解决重复性问题要求调节PCR反应组分。多重反应中试剂组分的优化编辑本段回目录引物的量.最初，在多重PCR反应中使用了相等物质量的引物(每种引物为0.2-0.4四M)(Figure3c)。但是扩增并非均一的，即使在优化了循环条件后，某些基因的扩增产物仍不明显。解决这一问题，要求改变反应中各种引物的比例，要增加"弱”基因的引物量，而要减少”强”基因的引物量。不同基因相对的引物终浓度有明显的差异(0.04-0.6四M)，这完全取决于经验。

Um*m质©[重cdiruim断L一WnWftJ_15蛆——•gIMHIm硕甲呻1匕m"i■二rw/可妣山«nnw・nar口mn白塑用u「]n"码顽syxy-rE为1、PCT2>PCRIy”叫kPCRHPC岸港小但十庭RbPCftFtEureJ.^aiEiten^ijntime.Mulliple^ft'RDfmiitLiresV-(10Y-I.connpnrihePGTRprogramsC(2-minwflffiiwwiHme),ndA(kmin用点mtimgtS4c钏门圈!irigt翌purahiT也，EpEpari^FiDf《聊NM印+L^ney-^hou/sanimptovemanlinyieldwhedxLenaonttmeLi2min.SocuefuinluuEpMifichan出apjjeiti.puwUilyduetothclowbufferconcwtr响on(lx),fb)EKteraicjitime.MultipieKPCRwithmixmrtX-5(primerstorDMDgfneexonsNos.PM.?.503&.6U)andprimerpairY6BiiH?4〔910-bppiDducLupperttpw).Piinwsgivinpshen^rani^ifiutKraprodu^fampr^fbitniiallyanyplifi«dwithwlnrtmUm*m质©[重cdiruim断L一WnWftJ_15蛆——•gIMHIm硕甲呻1匕m"i■二rw/可妣山«nnw・nar口mn白塑用u「]n"码顽syxy-rE为1、PCT2>PCRIy”叫kPCRHPC岸港小但十庭RbPCftotawg.]englhIndividui]productshavecompardblemienulies.Whenrquimolatimomibofprimersversmix狷Eorth^nmltip]^r花ction(HcmInnen.somepr中血订行^tveemteftlfisntK^rnplifigdbutldi-specifitpnjtkicfesdi-sjppeired.qd-f)Aimealmgtetnptsraiure,builetconjeoiinitiona.ndnumber0Fprimets.Multiplex^mplifkadcnafniiirure¥」*(Hrst([onesinesch$』)，primerpairs¥IS3〔lii做4-6)jridhumlire1'-.：11"心-:12iriI■ur?■f'(.KbuMuriellnc<dilkl:cnlt^mpl,i：cl」NLI11ePC'<progranvtdifftrin^inannealingifTnpei^ii[e{4S54'or59X2],Lanes1-9tneachgelsliowreaciiDTisinl-I1t'ElbuFKi.Lackerl&-!2cmeach枣I*10四reaction^in2•1*CttbLillsr.L^ritss7-dlleach(untknI-PCRand2-PCRjw^rivithprimers^itV-^.TheverylastIsn^inFigure3ndand「指日icmarker(l-lchladder).£injllhorizoutAtindtaietheocped«iprcducixofmixtuneY-3*(£vepeoduett)includir^the]口哩est&pecificproductcmihege],Gblique-arrow1indiastronguispecificproducl普□lidarrowmads：1ndktheiwu如曜pnxiuctsexpectedinmiKiULe(toialor中甄product)comparedwiHiArrowheadauiJjnessJiawposttionsofsomeinlosingproduct*|e.g.,fintlanej.Wtl3iiniil-tifriexatupltficEiitt]A48X,nunyunspecificbandiappear.InUPCRbidTer,the1Y153prackeihstrongerwhenamplifiedinminuneY-i*(5primerpair?]thaninmixtiir^V-3(7primerpairsrivliichslio曾mh&t脯I自潴tforson«pnrdLiEt^.anLncnj^^dniitn^rufflirtwihiir^unlv^nipliMe&i】iiitlu-encetheyieldatsome■ipecifieIdcl.Rsi^itliePCR.bufferconeentratiiori,from1xto2xa3]av^amoreev^nainpliftcationofaLE«peeifkproductsandtvlplodecmtethei11tmityofmanyIdn^erunspKifkprodLicfs(conwardhues7-?vs.10-12]Thestrang+7C-480-bpun&peejficbund(obliquearrew)saenwithlxbuflierwaseliminitedbyvaryi瓯lheproponnnofdifftnatprimenintheraoeiicn(eonipaieTftilhY-?.Fksur自2b=).AL?9'CEh-e^YI53ptoduemmbe^eencjilywhen>bufk-rkn&f己eh■州■的11e；d-愈馆皿P】由Mila皿dNTP和MgCl2的浓度・dNTP.用引物混合物Y-4检测了多重PCR反应中dNTP浓度的影响。氯化镁浓度保持恒定(3mM)，而dNTP的浓度从每种50gM逐渐增加到每种1200四M(Figure4b)。当dNTP浓度为每种200gM和每种400gM时结果最好，浓度继续增加时扩增被迅速抑制。降低dNTP浓度(50gM)不抑制扩增，但扩增产物的量会减少。dNTP母液对于反复冻融十分敏感，反复冻融3-5次后，多重PCR反应常常不能很好进行，扩增产物几乎完全不可见。为了避免这一问题，应分装出小份的dNTP(25mMeach,2-4gL,10-20次反应)，冻存于-20°C，使用前离心。dNTP的这种低稳定性在单一基因扩增中并不明显。Fl耕谜*(町AjnplifiejLbOHwithtwadi(firantDNA食mpJiiiwii如$pa仍心‘iriituh?¥-?-in1.4■:P<Rbuffer.叫2hnuT^fisinfnuntb^cFcyclesbyunik甲『Htt折lb)dNTPErx郎打沛on,R'RsrnplifixationusingmixtuneV-4in2f\'Hbufi^erjtMMgCli?andiricrea^mfct*ncairationsofdNTP^SO.10fl_JOO.40G,600and1100|aMj,Most^FEcieiitajnpliflcahcnisjc^riatcancentralionsof200-400pMdNTP.FurtlwriE旧心成inth©dNTFEHEinr州估!iinhibitsthdrsiclienwh^nMgCI：c^ncentratipni»k«pltqnsia>il,(tJMh1^ti<jitMuliip]?\PCRwasperformedwjtlit浦蛆厦网Y-3in【,4乂IX'ltbuffeh血rigE*CRpre时司mEnnd£忸duallyraiseiigIhedhientra[ioHcfMgCK.【d)PCRbufFerconcentrnticn.AmplificnticmprcHlLictsofmistureX-1〔DMDgenwe^cnsNos.45.PkL19.]7_51.8一口一44and4)监n峪incicaiinccDnewitroiioinofFCR.buH^r顼dpro^rmiEAstheitrinfCTicy\nrhe足衅ilgm-httu^dee啪做.声hortwW申duel^勃国值河叩申mcfflpitiitly,中律叫罪th?int^^itycflongerprodicisgraduallydeaaM&Fw此i&panieularprimermiktui%.lheoptimalIwflerconesitratianwasI.J^-l.t■'.i?}ComparisonofPC'Rbuffers.CcmpLirisoncfmultiplexPCrRafJTixtLireX-1intheDMDbufferanirhe3.&-KCl-btised]VR.butTerHusdng出*Mmeproportioncfinfrwiiertts(DNA.ToqONApalyinerase.primerj.n.iOLnil|nn』PER.pFCtgrnmE.Furever^DKAlajnpk?tListed,tlieamcurititoTprodiid«wmiftt州3坚dwh』i1.6*PTRbtifferimuj«d.OnlyR»wlanesshown,althoughlhegdhudmoresanitieshided,sndidenticiJresultsvv虐「eebsen^d{f)Xmcun!cTterriplHtuDNA.VinoLissniaunteoftenipliateDNAwereamplifledvithpurersYIS3andniLKtureWin2〈PCS!butferwithpro^rMtiE.Rjeaclionvolumeswere25\il_.Therew?renoiwjcirdziCf口]wncEELiiin^500e3。ngDKA:hevt^er.sori'tiEntkbecjuncwadkttr山占DNASHtoimtwailiirtbwidec^iiedtj。与iig;2S|jt_m：ol-Hm0fliiijiHdiRereHte%ddetatheDN.A昆口中1制ec的*t?hirE井^hen声扁打因/』¥"以处UMdElk睨.赢么"甑MgCl)在dNTP浓度为每种约200gM的标准PCR反应中MgCl2的浓度建议为1.5mM。为测试MgCl2的影响，将dNTP浓度保持在200gM进行多重PCR反应(mixtureY-3),MgCl2浓度从1.8mM逐渐增加到10.8mM(Figure4c)。随着MgCl2浓度的逐渐升高，扩增反应的特异性逐渐增强(非特异性条带消失)，产物量逐渐增多(10.8mM)。在MgCl2浓度为20mM的PCR反应中，产物几乎不可见，似乎反应被抑制了。dNTP/MgCl2的平衡.TaqDNA聚合酶正确工作时需要游离的镁离子(9)(不包括与dNTP和DNA结合的镁离子)。这也许是dNTP浓度增加时扩增反应被迅速抑制(Figure4b)而增加镁离子浓度能消除这种抑制现象(Figure4c)的原因。通过对各种浓度dNTP和MgCl2的组合实验发现，浓度为每种200gM的dNTP要得到最好的扩增结果需要1.5-2mMMgCl2，而浓度为每种800gM的dNTP要得到最好的扩增结果至少需要6-7mM的MgCl2。浓度为每种200gM的dNTP扩增反应要求的阈值为1mMMgCl2，当MgCl2低于这一阈值时，扩增会减少。PCR缓冲液（Kcl）的浓度.KCl或PCR缓冲液浓度.提高PCR缓冲液的浓度为2x（或仅将KCl的浓度增加到100mM）可以提高多重PCR的效率（Figure4d及Figure3,d-f），这种调节作用比调节DMSO，甘油或BSA更重要。通常产生长片断扩增产物的引物在低盐浓度下扩增结果更好，而产生短片断扩增产物的引物在高盐浓度下扩增结果更好，高盐浓度会使长片断扩增产物难于变性解链（比较Figure4d中0.4x缓冲液与2.8x缓冲液）。例如，sY94引物对（熔点为58°C）在缓冲液的浓度为0.8x时扩增效果优于sY88引物对（熔点为58C）和SY151引物对（熔点为52C），但在高的盐浓度条件下，SY94引物对的扩增效果无明显优势。合适的缓冲液浓度可以克服产物大小和GC含量等因素的影响。PCR缓冲液的比较・我们还比较了原先提到的被称为DMD的多重PCR缓冲液（6）和相对简单的KCl缓冲液在多重PCR反应中的差异。5x的DMD缓冲液含有83mM（NH4）2SO4,335mMTris-HCl（pH8.8）,33.5mMMgCl2,50mM-mercaptoethanol叩一巯基乙醇）和850gg/mLBSA，缓冲液DMD的使用终浓度为1x，与10%DMSO和1.5mMeachdNTP同时使用（1,2,4）。实验表明用1.6x的常规KCl缓冲液比用DMD缓冲液扩增DMD基因（引物混合物X-1）效果更好，明显见到更多的PCR产物（Figure4e）。实验结果使用病人的DNA样品做了十二次重复，重复性很好。KCl缓冲液相对简单，便于调节和优化实验。低dNTP浓度时TaqDNA聚合酶的保真性更高（9）。使用KCl缓冲液（要求更少的dNTP）有利于对PCR产物做进一步的突变分析。模板DNA的量和TaqDNA聚合酶.当每25gL反应体积中DNA的模板量为30ng到500ng时，混合物Y-3*未表现出明显差异（Figure4f），然而当模板量低于30ng时，某些PCR产物的量会减少。当模板量很低时（pg级的DNA），扩增的效率与特异性可以通过进一步降低退火温度来优化，有时甚至要降低10C-12C（数据未显示）。使用引物混合物Y-3（Figure5a）来测试不同TaqDNA聚合酶的浓度（Perkin-Elmer）。TaqDNA聚合酶的最适浓度为每25gL反应体积中0.4gL或2U。也许是由于TaqDNA聚合酶中甘油浓度过高，加入过多的TaqDNA聚合酶会导致不同基因扩增不平衡及背景的轻微增高。在1.6xPCR缓冲液中使用自制的五种不同来源的TaqDNA聚合酶（每25gL反应体积中加入2U）对Y-4引物混合物的反应体系扩增得到了相似的结果（Figure5b）。佐剂的使用：DMSO,甘油,BSA（Step5E）.许多作者建议使用浓度范围为5%-10%（v/v）的DMSO和甘油来改善扩增的效率（提高产物量）和特异性（没有非特异性产物）（9）。然而在多重反应中，DMSO的使用会给出矛盾的结果。例如，5%DMSO增加了某些基因的产物量，减少了另一些基因的产物量，而对某些基因却没有任何影响（Figure5c）。使用5%的甘油也得到了相似的结果。因此，DMSO和甘油的调节对实验结果的影响要根据具体的实验来摸索。加入浓度达0.8gg/gLBSA（比以前描述得更高）比加入DMSO和甘油更能提高PCR扩增的效率。BSA对任何基因的扩增都未产生抑制作用。4.〔町AmaiLnta(etizymi.Aniplitiratjanpiuduui!,eKmiiuueV-.irLiningtl.5,I,2,4andSU.25piLrenrlionvolumeareabawiLAitowsindicat已theespectedposltioltsoftheajnpSsficaticnprod-uclEThetticslippnoprimeenzymetonkientraliofiwasbetTi^en1-21'2pL.[bfSourceofenz^TiieMul-hjjJcRI'CflofmtxiuwY-4in1.6>Ptril如10usm啊SUplvnerA^u成m顷呻虾ihawsthepradLctsobtJinKlwhenlheeiiz^Tiierrcmilajje-3waiusedmttiebuflerpruYidedtrydievaitioLAnugpeciScpivducl呷匏旧d,lc)Umeufsdjuvanh.CCTRpara.ti^'entiilliplexTCRl旧ijigiheY-specifkniixlfiretuilh5"..&MEOthtpBifoiptD)nndwithnulDMSflJn】•buffer】oeisYlSl■andW肿fromimtlunuY*