7植物基因组DNA提取-CTAB法

高等植物总DNA提取

——CTAB法AB法实验类型：验证型一、实验目的与要求掌握CTAB法抽提植物DNA的基本原理。学习并掌握CTAB法抽提植物DNA的技术和方法。二、实验原理（一）植物细胞中DNA在哪里？怎样获得？植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA、染色体DNA、核基因组DNA，细胞质中也有少量DNA，主要分布在线粒体、叶绿体内，称为核外DNA。细胞内的各种DNA称为总DNA。程序：破壁破膜→去蛋白质→沉淀DNA（二）获取程序及原理1.破壁破膜，释放染色体利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；然后加入CTAB缓冲液。有效制备DNA时要考虑两个原则：防止和抑制内源DNase对DNA的降解；尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程中DNase无法活动。加入CTAB，cetyltrimethylammoniumbromide（十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂）破坏细胞膜，使大分子DNA释放到提取缓冲液中；保护DNA不受内源核酸酶的降解;由于液氮研磨对组织破碎程度很高且均匀，当加入螯合剂（如EDTA、柠檬酸，通常10-100mM）后，DNase所需的辅助因子Mg2+或Mn2+尚未开始作用已被螯合剂掩盖；从而抑制DNA酶活性。

CTAB与核酸能形成复合物，在高盐溶液中可溶，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。

上清液中DNA再用氯仿-异戊醇混合液抽提，震荡使核蛋白溶液乳化，然后离心，变性的蛋白质凝胶便停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相，吸出上层水相便可除去DNA中的蛋白质等。2.去蛋白质、多糖等杂质3.沉淀DNA用异丙醇或乙醇沉淀DNA，而CTAB因溶于乙醇或异丙醇而被除去。三、实验材料与器具实验材料：大头菜的新鲜嫩叶实验仪器：水浴锅、台式离心机、冰箱实验器具：移液器、离心管、吸头、研钵和杵子、液氮罐实验药品：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、Tris（三羟基甲基氨基甲烷）、EDTA(乙二胺四乙酸)、氯仿、异戊醇、液氮、无水乙醇等1.2%

CTAB抽提缓冲液

CTAB

2g，NaCl8.18g

，EDTA-Na2-2H2O0.74g，

10ml1mol/LTris-HCl(pH8.0)，

先用70ml

ddH2O溶解,

再定容至100ml，灭菌,

冷却后加入0.2%

β-巯基乙醇0.2ml。终浓度：

CTAB

2%,NaCl1.4mol/L（生理平衡作用）,EDTA20mmol/L(螯合离子作用)，β-巯基乙醇100mmol/L或PVP（聚乙烯吡咯烷酮

）（降低氧化酶类的活性，防止酚氧化成醌，有效去除多酚。）2.氯仿-异戊醇（24:1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。3.1mol/LTris-HCl(pH8.0)500ml：称取60.57gTris，用盐酸调至pH8.0，具有缓冲酸碱度变化的作用。4.TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl(pH7.4)+

1mmol/LEDTA

四、实验方法与步骤1.准备：2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热2.破碎细胞：取少量叶片（约1g）置于研钵中，倒入液氮尽快研磨至粉状3.破膜、释放核蛋白：将3ml预热的CTAB缓冲液加入10ml的离心管中，再将研磨的粉末用药匙转移到离心管，充分混匀，65℃水浴中10min，每隔几分钟

，轻轻摇动（目的：65℃下染色体充分释放）4.沉淀蛋白质及多糖杂质：8000r/m离心10min。5.抽提除去蛋白质等杂质：将上清液转移到另一个离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，混匀后，12000r/m离心5min。6.沉淀DNA：用移液枪将上层水相吸入另一离心管中，加2/3体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于4℃下放置10min或-20℃放置5min，使得核酸沉淀下来，用8000r/m离心5min。此时便可以观察到是否获得DNA沉淀。7.用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后，溶于适量的灭菌ddH2O或TE缓冲液中。1）选取新鲜、幼嫩的材料，避免研磨困难、材料含有较多的多酚类物质、提取产物有颜色等；2）研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀；3）为获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，还要避免核酸降解酶的降解。注意事项五、作业每两人提取一份DNA，请老师验收。撰写实验报告。在实验结果中说明每一操作步骤后DNA在哪儿。复习题（解释名词术语）核DNA核外DNA基因组DNA总DNA离心缓冲液螯合剂复习题（填空）Tris的中文名是

三羟甲基氨基甲烷。

CTAB的中文名是十六烷基三甲基溴化铵。DNase的中文名是脱氧核糖核酸酶。EDTA的中文名是乙二胺四乙酸。PVP的中文名是

聚乙烯吡咯烷酮。r/m（rpm）的中文意思是转每分。KAc的中文名是

乙酸钾（醋酸钾）。复习题（填空）TE的中文名是三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸。CTAB的作用主要是：溶解细胞膜，与核酸形成复合物。EDTA的作用主要是：螯合离子。巯基乙醇的作用主要是：降低氧化酶类的活性。CTAB法提取DNA的一般程序是：破壁破膜、去蛋白质、沉淀DNA。Tris-HCl的作用：缓冲液，维持溶液pH值在8.0左右，防止过酸、过碱破坏核酸。复习题（判断）将DNA提取液65度温育20分钟，可以灭活DNase。（

）在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加氯仿/异戊醇抽提的次数