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文档简介

试验三

茚三酮显色法

测定氨基酸含量茚三酮法测定氨基酸含量专家讲座第1页一、原理：茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。颜色深浅与氨基酸含量成正比，可经过测定570nm处光密度，测定氨基酸含量茚三酮法测定氨基酸含量专家讲座第2页二、试剂与材料（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液（本试验用赖氨酸）(已配)（2）pH5.4,2M醋酸缓冲液：量取2M86ml醋酸钠溶液，加入14ml2M乙酸混合而成。用pH计较正（250ml/班）（3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解（15ml/组）茚三酮法测定氨基酸含量专家讲座第3页还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不停出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，真空干燥，置五氧化二磷真空干燥器中保留备用茚三酮法测定氨基酸含量专家讲座第4页（4）60%乙醇（20ml/组）（5）样品液：每ml含0.5~50ug氨基酸（已配）（6）分光光度计（7）水浴锅茚三酮法测定氨基酸含量专家讲座第5页三、操作方法1、标准曲线制作：分别取0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml0.3mM标准氨基酸溶液于试管中，用水补足到1ml。各加入1ml2M醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充分混合后盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min

后，加入3ml60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440）。以OD570为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线茚三酮法测定氨基酸含量专家讲座第6页2、氨酸酸样品测定：取样品液1ml，加入pH5.4,2M醋酸缓冲液和茚三酮显色液各1ml混匀后于100℃沸水中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3ml60%乙醇稀释，摇匀后测定OD570（生成颜色在60min内稳定）将样品测定OD570与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量样品同时做三份取平均数茚三酮法测定氨基酸含量专家讲座第7页四、结果与计算氨基酸含量(g/100ml)=X*100X为查标准曲线所取得每ml含量g数自配样品X*250/称取克数（X为查标准曲线所取得每ml

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