血液核酸检测SoGAT回顾专家讲座

血液核酸检测10年SoGAT回顾NAAT10Years:SoGATreview1血液核酸检测SoGAT回顾第1页SoGAT

基因扩增技术标准化工作组

StandardisationofGenomeAmplificationTechniques

http://www.nibsc.ac.uk/spotlight/sogat.aspx确定血液病毒核酸检测标准化需要；促进血液病毒核酸检测国际标准品建立；将标准品用于血液病毒核酸检测标准化。2血液核酸检测SoGAT回顾第2页SoGAT历史1994年11月23日，欧洲血浆分离法协会(EPFA)与英国国家生物制品检定所(NIBSC)在芬兰联合举行了一个研讨会；1995年4月11日，第1届SoGAT会议在英国举行；血液病毒核酸检测标准化，比如HCV、HIV、HBV、B19；新检测技术不停涌现，商业化检测蓬勃发展，决定使用参比物质对血液病毒检测进行标准化。1999年10月29日，第10届SoGAT会议在英国举行；1999年7月1日，欧洲血站系统正式开展HCVNAAT年5月28日，第21届SoGAT会议在比利时举行；年4月14-15日，第22届SoGAT会议将在罗马举行。3血液核酸检测SoGAT回顾第3页SoGAT机构设置4血液核酸检测SoGAT回顾第4页SoGAT主要工作制订国际标准品和参比试剂；研发新一代参比物质；制订核酸量(gEq)、抗原量(IU)、感染性(copy)相关系数；举行合作研究；进行学术交流。5血液核酸检测SoGAT回顾第5页血液核酸检测10年SoGAT回顾血液筛查NAAT应用历史与经验输血风险评定方法演变NAAT策略：MPvs.ID技术与经济问题血液病毒核酸检测标准品血液病毒检测系统及其评价体系6血液核酸检测SoGAT回顾第6页血液筛查NAAT应用历史与经验德国应用NAAT历史与经验英国应用NAAT历史与经验日本应用NAAT历史与经验台湾应用NAAT争议7血液核酸检测SoGAT回顾第7页德国应用NAAT历史与经验

BloodScreeningNAATinGermany背景介绍HCVNAATHIVNAAT小结MichaNüblingPaul-Ehrlich-Institute8血液核酸检测SoGAT回顾第8页背景介绍时间：1999-检测量：450万/年检测机构德国红十字会 7centers 75%医院协会 75centers 20%私立机构 5centers 5%检测策略1999-HCVmainly96Pools；-HCV/HIVmainly96PoolsHome-made试剂检测灵敏度HCV 5000IU/ml(0copies/ml)HIV 10000IU/ml(5000copies/ml) 9血液核酸检测SoGAT回顾第9页HCVNAAT1999-共检测4080万标本检出92例HCVNAAT阳性标本检出率：1/440万76个检测中心检测到HCVNAAT阳性标本高检出率中心#47 6/202435=1/33700#15 16/587000=1/36700#08 9/427000=1/47400低检出率中心#30 4/4415033=1/1100000#52 6/6713709=1/110#23 0/903948=0/90394810血液核酸检测SoGAT回顾第10页IntroductionofNAATAmpliScreenHCV/24漏检HCV输血感染HCVNAAT阳性11血液核酸检测SoGAT回顾第11页-10 上一次献血

antiHCV(Ortho3.0)阴性 HCV-RNA(AmpliScreen/24)阴性-01 重复献血者: 血清转换(anti-HCV,HCVRNA)

HCVgenotype2b

回溯

受血者

(红细胞)

HCVRNA阳性 HCVgenotype2b 血浆进行IDNAAT Plasmareplicatetesting(n=5)inallavailable NAATsystems12血液核酸检测SoGAT回顾第12页HCV输血传输NAAT检测系统95%LODIU/ml(WHOIS,Genotype1)IDNAAT阳性结果血筛NAATsCobasAmpliScreenHCVTestv2.0291/5CAPCobasTaqScreen115/5ProcleixHIV/HCVAssay20/5ProcleixUltrioAssay32/5临床诊疗NAATsCobasAmplicorHCVTestv2.0431/5HPSCobasTaqManHCVTest153/5CAPCobasAmplicorHCVTestv2.0113/5CAPCobasTaqManHCVTest133/5VersantHCVRNAQual100/5AbbottRealtimeHCV114/513血液核酸检测SoGAT回顾第13页HIVNAAT-1900万donations11个HIVNAAT阳性标本检出率：1/170万14血液核酸检测SoGAT回顾第14页HIV输血传输-01 上一次献血

antiHIV1/2阴性 HIV1RNA(CAPCTM/96)阴性-04 重复献血者: 血清转换(antiHIV1/2)

HIV1subtypeB

回溯

受血者(红细胞)

HIV1血清转换 HIV1subtypeB,variantasindonor

储存血浆

HIVAg/Abtest阴性(Abbott) 147IU/mlIDCAPCTM

15血液核酸检测SoGAT回顾第15页-04 重复献血者：NAAT-01

储存血浆

HIVAg/Abtest阴性(Abbott) 147IU/mlID(CAPCTMHIV)

作为原料血浆聚集：HIVRNA阴性HIVNAAT定性HIVNAAT定量CobasTaqScreenCobasAmpliScreenHIV(MP)ProcleixUltrioAbbottRealTimeHIV-1(IU/ml)CAMHIV(IU/ml)HPSCTMHIV

(IU/ml)CAPCTMHIV

(IU/ml)pospos(2/2)pos(5/5)924<LLQnegneg16血液核酸检测SoGAT回顾第16页ForwardprimerCAPCTMHIVTest (nt1788–nt1819)CTMPrimer:

5´AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA3´Donor:

5´AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA3´

ProbeCAPCTMHIVTest

(nt1821–nt1856)

CTMProbe:

5´TCTGCAGCTTCCTCATTGATGGT

A

TCTTTTAAC3´

Donor:

5´TCTGCAGCTTCCTCATTGATGGT

T

TCTTTTAAC3´ReverseprimerCAPCTMHIVTest

(nt1921–nt1950)CTMPrimer: 5´G

G

TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC3´

Donor:

5´G

T

TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTACC3´17血液核酸检测SoGAT回顾第17页小结德国现有血液安全系统控制策略能够确保较高血液安全性；低病毒载量标本和病毒核酸变异可能造成NAAT漏检，造成输血感染事件；与其增加

NAAT分析敏感性，不如提升NAAT对各基因型敏感性；输血零风险是一个高不可攀理想，NAAT只能近一步降低残余风险。18血液核酸检测SoGAT回顾第18页英国应用NAAT历史与经验

BloodScreeningNAATinEngland时期1998--核酸提取QiagenBiorobot+RNAextractionQiagenBiorobot+virusextraction核酸扩增与检测RocheAmplicoreRocheAmpliscreen95%检测限25IU/ml14IU/ml无效试验率5%5%无效运行率13%3%3.5IU/mlcontrol检出率35%45%残余风险1in10,000,0001in50,000,00019血液核酸检测SoGAT回顾第19页时期1999.04.01-.06.30.07.01-.03.31献血者类型重复献血者新献血者重复献血者新献血者筛查试验数5,117,292587,9613,938,618440,735TotalAnti-HCV(+)86(1/59503)320(1/1837)36(1/109406)202(1/2182)Anti-HCV(+)NAAT(-)(%)31(36%)75(37.1%)5(13.9%)34(16.8%)Anti-HCV(+)NAAT(+)(%)46(53.5%)223(69.7%)25(69.4%)165(81.7%)Anti-HCV(+)NAAT(未检测)92263Anti-HCV(-)NAAT(+)2(1/2558646)1(1/587961)5(1/787724)0(0/440735)20血液核酸检测SoGAT回顾第20页小结血清学检测与NAAT是不一样层次检测；血清学检测扩大排除潜在风险，阳性就有感染可能；血清学检测不能完全排除输血风险，存在血清学窗口期；NAAT阴性未必不含有感染性；NAAT也有NAAT窗口期，能检出基因型和时间也有限，其作用是关闭一定血清学窗口期。21血液核酸检测SoGAT回顾第21页小结制订核酸检测策略时应该考虑疾病感染率和流行率。感染率(IncidenceRate)是指一定时期内疾病在风险人群中新感染率；

Theincidencerateisthenumberofnewcasesperpopulationorunitofperson-timeatrisk.流行率(Prevalence)是指一定时期内疾病患者总数，包含已经感染和新感染两种情况；

Prevalenceisdefinedasthetotalnumberofcasesofthediseaseinthepopulationatagiventime.22血液核酸检测SoGAT回顾第22页日本应用NAAT历史与经验

BloodScreeningNAATinJapan1997年11月，将NAAT用于原料血浆筛查；1999年4月，将NAAT用于血站献血者筛查，成为最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIV核酸检测国家；年，针对本国流行基因型设计检测引物并建立国家标准品；国际标准品国家标准品检测限HCV(基因型)1.0x105(1)1.0x105(1b)74HBV(基因型)1.0x106(A)4.4x105(C)15HIV-1(基因型)1.0x105(B)1.4x105(B)134IU/mL23血液核酸检测SoGAT回顾第23页24血液核酸检测SoGAT回顾第24页血清学筛查阳性率HBsantigen0.1%HBcantibody0.4%HCVantibody0.1%HIV-1/2antibodies0.05%HTLV-1antibody0.1%ALT(GPT)2.0%Serologicaltestforsyphilis0.2%HumanparvovirusB190.01%25血液核酸检测SoGAT回顾第25页NAAT检出率1999.7-.4(500Pool)HCVNAAT:9/2,560,977，1/28.4万HIV-1NAAT:0/2,561,000HBVNAAT:26/2,560,977，1/9.8万.2-.12(50Pool)HCVNAAT:46/16,012,175，1/34.8万HIV-1NAAT:16,012,175，1/266.9万HBVNAAT:308/16,012,175，1/5.2万26血液核酸检测SoGAT回顾第26页IDNAAT对转换前标本检出率HBV转换数IDNAAT阳性数ID-NAAT阳性率MPNAAT8033.75%HBsAg12453.7％HBcAb3269331.0%Total3473411.16％27血液核酸检测SoGAT回顾第27页小结针对本国流行基因型设计引物并建立国家标准品，选择适合本国流行基因型NAAT试剂；因地制宜开展集中化、自动化检测；血清学检测以及之前办法能够排除大部分风险；核酸检测仍就存在窗口期28血液核酸检测SoGAT回顾第28页台湾应用NAAT争议2009年上六个月，献血者Anti-HIV阳性比率为4.88/10万，比前年同期激增近一倍，其中以学生群体百分比最高，占两成。台湾消费者文教基金会痛批台卫生署“草菅人命”，23年來已经有18人因输血而感染艾滋，但卫生署却未采取适当办法。消基会呼吁：卫生署应马上编列預算，使用更NAAT全方面筛检血液，防止悲剧重演。据台湾血液基金会预计，台湾现行使用血清学检测，平均每年使一人因输血而感染HIV，607人感染HCV和HBV，每年支付3.3亿医疗费。29血液核酸检测SoGAT回顾第29页台湾应用NAAT争议当前，台湾是“亚洲四小龙”中唯一未全方面采用

NAAT

地域；近年来，NAAT在台湾一直停留在试办阶段，由政府补助每年仅随机筛检10万人次；年起，即使血液基金会将投入5千万，把筛检人次提升到15万，但台湾每年有180万人次捐血，二者差距悬殊；卫生署以输血感染艾滋个案甚少，而且“不符合成本效益”为由，决定维持现行血清学检测；30血液核酸检测SoGAT回顾第30页台湾应用NAAT争议卫生署医事处处长石崇良表示，“用NAAT筛检一年要花5亿，每年却不到1人因输血感染艾滋病，机率比中乐透还低，这5亿与其用来做血液筛检，不如分给感染者，可能还比较有意义”。血液基金会业务处处长林敏昌指出，“NAAT原来就不符合成本效益，各国还不是照做，因为健康与血液安全是无价！”最少加拿大、美国、新加坡等国，NAAT检验费是由政府全部或部分支付；艾滋病感染者权益促进会秘书长林宜慧表示︰“应以一件都不能犯错理想为目标，拿5亿来改进台湾血液安全算多吗？”31血液核酸检测SoGAT回顾第31页小结血液安全Vs.成本效益输血风险终究来自哪里？血清学窗口期/血清学试剂不够灵敏/血站管理问题血液安全系统策略是否完善？高危行为发生后寻求病毒检测心理会使处于感染窗口期献血者增加；团体献血，个体易在同伴压力下捐血，不然“会被他人认定是有问题”；献血代替婚检；献血员筛选/问卷调查/自信排除残余风险率Vs.成本效益率32血液核酸检测SoGAT回顾第32页输血风险评定方法演变回溯性研究时期(1970-1985)直接度量时期(1985-1990)模型评定时期(1991至今)33血液核酸检测SoGAT回顾第33页模型评定风险1991至今度量风险1985-1990回溯性研究1970-198534血液核酸检测SoGAT回顾第34页HCV输血风险直接度量80年代后期，FACTS(FrequencyofAgentsCommunicatedbyTransfusionsStudy)利用库存标本对HCV输血风险进行了直接度量。筛查之前，HCV输血风险为1:2,000；ALT和HBcAb筛查，HCV输血风险为1:5,000；Anti-HCV1.0筛查之后，HCV输血风险为1:30,000；进行Anti-HCV2.0筛查之后，HCV输血风险急剧下降，而不能直接度量了。35血液核酸检测SoGAT回顾第35页风险评定(IR-WP)模型90年代初，IR-WP模型被提出和初步完善；理论基础：输血安全最大威胁是处于感染窗口期献血者，其它原因(病毒变异、免疫静默携带者、检测错误)只占很小一部分；经过献血者感染率(IncidenceRate,IR)和窗口期(WindowPeriod,WP)相乘来评价残余风险率(ResidualRisk,RR)，RR=IR×WP；残余风险率能够了解为感染者在窗口期献血概率。36血液核酸检测SoGAT回顾第36页风险评定Busch模型年，MichaelBusch针对经典模型不足进行改进，提出风险评定新策略——Busch模型。该模型依然以IR-WP模型为基础，利用新理论和新方法对感染率和窗口期进行阐述和推算。MichaelP.Busch美国血液系统研究所所长加利福尼亚大学教授37血液核酸检测SoGAT回顾第37页T-IT-IT-IT-IIT-IIT-IIT-IIIT-IIIT-IIIEIA3.038血液核酸检测SoGAT回顾第38页血清学残余风险率计算血清学RR=IR×WPIR=MP-NAAT检出数/(献血次数×T-III)WP=T-I+T-II血清学RR=MP-NAAT检出率×(T-I+T-II)/T-III39血液核酸检测SoGAT回顾第39页中国输血风险评定中国不适合采取模型评定方法重复献血率低；输血感染事件发生率高；血清学检测没有到达坚实质量水平，输血风险没有降低到残余风险程度；中国应该采取直接度量方法计算输血风险输血风险率=输血感染率40血液核酸检测SoGAT回顾第40页NAAT策略：MPvs.ID技术

与经济问题MPvs.ID技术问题窗口期残余风险率检出率MPvs.ID经济问题成本工作量成本效益分析41血液核酸检测SoGAT回顾第41页MPvs.ID技术问题HCVHIVHBVIDMPIDMPIDMP窗口期(天)4.917.415.619115-34240-502残余风险率1in2,700,00011in1,800,00011in3,700,00011in2,300,00011in769,00031in526,0003检出率Add1in6.7million4—Add1in5million4—1in125,00031in500,00031Busch,,Transfusion

45,254-2642Comanor,,Voxsanguinis

91,1-123Kleinman,,JClinVirol

36Suppl1,S23-294Stramer,,Archivesofpathology&laboratorymedicine

131,702-70742血液核酸检测SoGAT回顾第42页来自SusanL.Stramer统计假阳性MPNAAT:0.001-0.0025%(1:40,000-1:100,000)IDNAAT:0.08-0.18%(1:555-1:2150)32-180X(80Xmean)每10万次检测会造成130donations损失造成可观经济损失，宝贵标本无法挽回损失MPNAAT分辨过程使其比IDNAAT多进行一轮检测43血液核酸检测SoGAT回顾第43页MPvs.ID

经济问题成本:Pool=PoorIDNAAT比MPNAAT高3-5$/人份；工作量适当Poolingsize能够降低检测工作量，提升工作效率；成本效益分析(Cost-effectivenessanalysis)

44血液核酸检测SoGAT回顾第44页血液安全核酸筛查成本效益分析血液安全核酸筛查成本首先来自筛查试验花费，另首先来自筛查过程中因为假阳性结果造成血液废弃和献血推迟等损失。标本采集、保留和运输筛查试验与验证试验延迟、淘汰与报废血液安全核酸筛查效益主要来自筛查所防止输血感染。经济层面：治疗费用社会层面：生活质量损失45血液核酸检测SoGAT回顾第45页生活质量改进指数

(Quality-adjustedLifeYears,QALY)QALY是用来评价医疗办法效果指数，既包含生活数量，也包含生活质量。健康生活一年QALY为1，死亡QALY为0，残疾或疾病状态QALY为0-1。生活质量损失指数

(Disability-adjustedLifeYear,DALY)DALY是用来衡量疾病危害指数，由WHO首先提出，既包含失去生活数量，也包含失去生活质量。健康生活一年DALY为0，死亡DALY为1，残疾和疾病状态DALY为0-1。46血液核酸检测SoGAT回顾第46页成本效益分析模型MarkovDecisionModelCost-effectivenessrate

=(CER)Costs–BenefitsQALYgained≈DALYDisability-adjustedLifeYear筛查方法确立筛查费用统计筛查成本确立疾病转归模型确立残余风险率评定确定疾病转换与死亡概率治疗费用计算QALY计算47血液核酸检测SoGAT回顾第47页筛查方法确立基础筛查:anti-HIV,anti-HCV,HBsAg,anti-HBc,HIVp24antigenNAATforHCVandHIVMP-NAATforHIVandHCVMP-NAATforHIVandHCVMP-NAATforHIVandHCVdeleteHIVp24antigenID-NAATforHIVandHCVID-NAATforHIVandHCVID-NAATforHIVandHCVdeleteHIVp24antigenNAATforHCV,HIVandHBVMP-NAATforHIV,HCVandHBVMP-NAATforHIV,HCVandHBVMP-NAATforHIV,HCVandHBVdeleteHIVp24antigenID-NAATforHIV,HCVandHBVID-NAATforHIV,HCVandHBVID-NAATforHIV,HCVandHBVdeleteHIVp24antigen*FromJackson,,Transfusion

43,721-72948血液核酸检测SoGAT回顾第48页筛查策略成本效益率成本效益率低于$50,000/QALY时NAAT最高成本(美金/标本)MP-NAATforHIVandHCV$5.8million/QALY(4.7-7.0)$0.13ID-NAATforHIVandHCV$8.4million/QALY(7.6-9.2)$0.18MP-NAATforHIV,HCV,andHBV$7.6million/QALY(5.7-10.6)$0.13ID-NAATforHIV,HCV,andHBV$9.1million/QALY(7.8-11.2)$0.19MP-NAATforHIVandHCV;discontinueHIVp24$4.3million/QALY(2.7-5.8)$4.13ID-NAATforHIVandHCV;discontinueHIVp24$7.3million/QALY(6.2-8.4)$4.18MP-NAATforHIV,HCV,andHBV;discontinueHIVp24$6.1million/QALY(3.8-9.5)$4.13ID-NAATforHIV,HCV,andHBV;discontinueHIVp24andanti-HBc$7.3million/QALY(5.5-9.9)$7.19*FromJackson,,Transfusion

43,721-72949血液核酸检测SoGAT回顾第49页血液病毒核酸检测标准品三级标准品一级标准品国际标准品(InternationalStandards)国家标准品(NationalStandards)地方标准品(LocalStandards)厂级标准品二级标准品50血液核酸检测SoGAT回顾第50页一级标准品(国际标准品)

InternationalStandards,IS由WHO-NIBSC制备发放，通常以IU为单位，普通只发给各国政府指定试验室，供各国家标准定二级标准品；IS是已经确定均一、稳定物质，所含标志物以及杂志都已准确定量；指定试验室有义务参加WHO组织国际标准品协作标定研究(合作研究)，无偿提供标定数据，且不得先于WHO发表载有相关数据论文。51血液核酸检测SoGAT回顾第51页二级标准品(国家/地方标准品)

NationalStandards,NS/LocalStandards,LS由各国对应机构自行制备，依据国际标准品为其赋值；制备、标定三级标准品；校准试剂；系统能力评价(PerformanceEvaluation)；治疗指南；52血液核酸检测SoGAT回顾第52页/FDA-CBERhttp://www.pei.dePaulEhrlichInstitute,Germanyhttp://www.iss.it/IstitutoSuperiorediSanita,ItalyEuropeanPharmacopoeiahttp://www.edqm.eu/53血液核酸检测SoGAT回顾第53页三级标准品(厂级标准品)由试验室配制，相关标志物由参考方法或二级标准定值，主要用于检测方法标准化和校准试剂盒“校准试剂”。http://www.bioQC54血液核酸检测SoGAT回顾第54页血液病毒核酸检测系统评价体系敏感性Sensitivity分析敏感性AnalyticalSensitivity临床敏感性ClinicalSensitivity特异性Specificity鲁棒性Robustness基因型敏感性GenotypeSensitivity统计学分析StatisticalAnalysis多中心性能评价

55血液核酸检测SoGAT回顾第55页敏感性Sensitivity分析敏感性(AnalyticalSensitivity)一级或二级标准品(StandardMaterials)统计学分析*计算得出95%检测限(LOD)或50%检测限(LOD)能够得出抗原量

(IU)与核酸量

(gEq)、

感染性

(copy)

换算系数临床敏感性(ClinicalSensitivity)三级标准品——转换血清盘(SeroconversationPanel)窗口期缩短(WindowPeriodReduction)大量临床标本敏感性/特异性/无效试验率*商业化检测系统说明书中应明确指出用来计算敏感性统计学方法。56血液核酸检测SoGAT回顾第56页鲁棒性Robustness鲁棒性又称稳健性，是指一个系统或某项设计对外界不利原因(包含样本性质、操作规程以及操作环境改变)承受能力。有效域值(GuardBand)分析无效试验率(InviladTestRate)交叉污染分析(CrossContaminationAnalysis)棋盘交叉试验57血液核酸检测SoGAT回顾第57页基因型敏感性

(GenotypeSensitivity)各流行基因型一级或二级标准品HCV:1a,1b;2a,2b,2c;3a,3e;4a,4c,4d,4h; 5a;6aHIV-1:GrupoMsubtypeA,B,C,D,E,F,G,H; GroupO;HIV-2HBV:A,B,C,D,E,F,G58血液核酸检测SoGAT回顾第58页Performanceevaluationofcobass201Vs.

Tigris

.AABB*Forclinicalsensitivity,samplesweretestedindividuallyontheTigris(IDNAAT)orinpoolsof6onthes201(MPNAAT).FeatureCobass201TIGRIS检测限(IU/mL)95%(50%)

HCV15.4(