抗体筛选和鉴定与交叉配血-长沙

抗体筛选、鉴定与交叉配血北京市红十字血液中心血液研究所血型室苗天红抗体筛选

《临床输血技术规范》第十七条：

凡遇有下列情况必须按《全国临床检验操作规程》有关规定作抗体筛选试验：交叉配血不合时；对有输血史、妊娠史或短期内需要接收多次输血者。

概念预期抗体：抗-A、抗-B意外抗体：同种抗体：ABO血型系统以外的抗体；ABO血型系统中的A亚型产生的抗-A1和B亚型产生的抗-B。自身抗体抗体筛选的目的抗体筛选的目的是确定患者血清中是否存在有临床意义的抗体。如果抗筛阳性，需要做抗体鉴定来确认有临床意义的抗体、最终选择合适的血液输注，同时提醒临床医生可能推迟提供配合的血液。抗体筛选应该作为输血前检查的一部分，它提供了比交叉配血更为可靠和灵敏的检测抗体的方法。（抗原的剂量效应等）抗体筛选或鉴定比配血更敏感，认为：最严格的配血能配上就安全的认识是不全面的。剂量效应Jka,Jkb,Fya,Fyb,C,c,E,e(noD),M,N,S,sM&NsM&NsKiddDuffyRhMNSs

临床有意义的红细胞抗体

临床有意义的抗体是指那些能够显著加快输注的红细胞破坏从而产生溶血性输血反应，甚至导致患者死亡的抗体。抗-A、抗-B、抗-AB必须作为临床有意义的抗体。除了少数例外，可能有临床意义的红细胞抗体指那些在37℃间接抗人球蛋白试验中有反应的抗体。抗体鉴定患者抗体筛选阳性，如果时间允许，应做抗体鉴定并评估其临床意义，抗体鉴定结果应记录在患者病历中。鉴定抗体类型：IgM、IgG。鉴定抗体种类：自身抗体、同种抗体。鉴定抗体特异性:抗-？输血科工作人员可根据抗体鉴定的结果判断配血的相合率和选择最佳的交叉配血方法。抗原检测的效率比盲配较高。同种抗体同种抗体的结果须永久保存有剂量效应的抗体及一些弱抗体，与相应抗原纯合子反应、与杂合子不反应，配血相合不能保证输血安全性。随着时间的推移，有些抗体会减弱甚至无法检出，配血相合，输血后会引起免疫记忆细胞在短时间产生大量抗体，引起溶血性输血反应。对于同种抗体，每次输血都应选择无对应抗原的红细胞成分，而非仅配血相合。

抗体筛选和鉴定重点讨论问题抗体筛选和鉴定使用的试剂抗体筛选和鉴定试验技术抗体筛选和鉴定结果分析抗体筛选和鉴定结果对交叉配血方法的选择交叉配血技术抗体筛选和鉴定的试剂筛选细胞、谱细胞抗人球蛋白试剂（试管法、凝胶卡）凝聚胺酶筛选细胞商品化的筛选细胞是2-3人份O型试剂红细胞。每一人份细胞单独在一试剂瓶中,不可混合,以避免对弱抗原表达红细胞的稀释。筛选细胞应保存在温控环境下，以减少贮存期间血型抗原的损失

。实验时如果用生理盐水洗涤试剂细胞,并用生理盐水或LISS液配成细胞悬液应在24小时内使用。过了效期的试剂细胞，即使不溶血或外观很好也不要再用，因为某些抗原已丧失。商品化的筛选细胞有人种的差异。筛选细胞（3%）筛选细胞（0.8%）谱细胞商品化的谱细胞有10、16、20人份O型试剂红细胞,每一人份细胞单独在一试剂瓶中。谱细胞应保存在温控环境下，以减少贮存期间血型抗原的损失

。实验时可用生理盐水洗涤谱细胞，避免细胞保存剂的干扰。用生理盐水或LISS液配成细胞悬液应在24小时内使用。过了效期的谱细胞，即使不溶血或外观很好也不要再用，因为某些抗原已丧失。商品化的谱细胞有人种的差异。谱细胞谱细胞抗人球蛋白试剂抗人球蛋白分类：单特异性的抗-IgG、多特异性的抗IgG+C3d。抗-IgG、抗IgG+C3d的抗球蛋白试剂都可用于抗体筛选和抗体鉴定。抗人球蛋白卡抗人球蛋白卡凝聚胺试剂盒酶抗体筛选和鉴定的技术患者血浆＋筛选细胞（谱细胞）患者血浆＋自身细胞（自身对照）方法：LISS-IAT法（低离子强度盐溶液-间接抗人球蛋白试验）由于它的速度快、灵敏度和特异性高，被公认为检测有临床意义抗体的最适合方法。LISS-IAT法（试管法、LISS/Coombs卡）。LISS-IAT法可以检测IgG抗体和37℃有反应性的IgM抗体。抗体筛选：存在血浆干扰时应选择试管LISS-IAT法。抗体鉴定：存在自身抗体时应选择试管LISS-IAT法、盐水介质-IAT法。抗体筛选（鉴定）-盐水介质试管法抗体筛选（鉴定）-试管IAT法盐水介质-IAT法方法：2滴血清（血浆）、1滴2-4%的红细胞，37℃孵育45-60分钟，离心观察细胞的凝集、溶血情况，生理盐水洗涤3遍后倾倒上清液，控干，加2滴抗人球蛋白试剂后混匀，1000g离心15s后判读结果。阴性结果用抗体致敏的红细胞检测试验结果的正确性。可以将细胞配成0.8%的悬液，加50ul到LISS/Coombs卡中，直接离心判读结果。优点：特异性好，减少自身抗体的干扰。缺点：灵敏度比LISS-IAT、LISS/Coombs卡差，耗时长。LISS-IAT方法：2滴血清（血浆）、1滴2-4%的红细胞，加2-4滴LISS液后混匀，37℃孵育15分钟，离心观察细胞的凝集、溶血情况，用生理盐水洗涤3遍后倾倒上清液，控干，加2滴抗人球蛋白试剂后混匀，1000g离心15s后判读结果。阴性结果用抗体致敏的红细胞检测试验结果的正确性。可以将细胞配成0.8%的悬液，加50ul到LISS/Coombs卡中，直接离心判读结果。优点：孵育时间短、灵敏度、特异性高，因为有洗涤步骤，可以排除血浆中的干扰物质。缺点：增强自身抗体的反应性（与盐水介质-IAT比）。PEG-IAT方法：2滴血清（血浆）、1滴2-4%的红细胞，加4滴20%PEG液后混匀，37℃孵育15分钟，（不可离心），用生理盐水洗涤3遍后倾倒上清液，控干，加2滴抗人球蛋白试剂后混匀，1000g离心15s后判读结果。阴性结果用抗体致敏的红细胞检测试验结果的正确性。可以将细胞配成0.8%的悬液，加50ul到LISS/Coombs卡中，直接离心判读结果。优点：孵育时间短、灵敏度比LISS-IAT高、特异性好，因为有洗涤步骤，可以排除血浆中的干扰物质。缺点：增强自身抗体的反应性（与LISS-IAT比）。凝聚胺试管中加入2滴血清（血浆）和1滴2%-4%红细胞悬液，混匀。以1000g离心15秒，观察结果。如果阴性则继续试验；如果阳性，需分析原因排除干扰后继续后续试验。加0.6-1mlLIM试剂，混匀后室温放置1分钟。加入2滴Polybrene试剂，混匀后立即以1000g离心15秒，弃去试管中液体，轻摇试管，肉眼判断红细胞凝集情况。如果有凝集出现则继续操作，如果没有凝集出现则该试验无效。加入2滴重悬液，轻摇试管，肉眼观察结果。结果判定：1分钟内凝集消失为聚凝胺试验阴性，1分钟内凝集不消失为聚凝胺试验阳性。对于可疑的弱阳性结果，可用生理盐水洗涤3遍后，加2滴抗人球蛋白试剂，离心后判读结果。酶技术用途：抗体鉴定：蛋白水解酶可修饰红细胞上的抗原，从而促进某些血型系统的抗原抗体反应，如Rh和Kidd系统；但蛋白水解酶也能破坏另一些血型系统的抗原结构，从而破坏其抗原性，如MN（M、N）和Duffy（Fya、Fyb）系统，这一特性可用于抗体鉴定。常用的酶

：菠萝酶（Bromelin）、木瓜酶（Papain）、胰蛋白酶（Trypsin）、无花果酶（Ficin）等。一般试验中常用的是菠萝酶、木瓜酶、无花果酶。方法：一步酶法（直接法）二步酶法（间接法）一步酶法（直接法）在血清和红细胞反应体系中直接加入酶溶液，促进血清中的抗体与相应红细胞抗原的反应，产生特异性凝集。操作：在标记好的试管中加入2滴血清和1滴2-4%的红细胞悬液，再加入1-2滴酶溶液，37℃孵育15-30分钟，1000g离心15秒，轻摇试管，判读结果。如需要，可进一步做抗人球蛋白试验。结果判定：出现红细胞凝集为阳性结果，红细胞不凝集为阴性结果。注意事项：通常需设阴性、阳性和自身对照。二步酶法（间接法）先用酶处理红细胞，洗涤除去酶液后，再与血清混合，使血清中的抗体与相应红细胞抗原的反应，引起特异性凝集。操作：试验分二步。1.酶处理红细胞：一份洗涤过的压积红细胞加一份酶溶液，37℃孵育15-30分钟（具体时间需要对该酶进行测试），用生理盐水洗涤3遍后配制成2-4%的红细胞悬液。2.在标记好的试管中加入2滴血清和1滴2-4%的酶处理红细胞悬液，37℃孵育15-30分钟，1000g离心15秒，轻摇试管，判读结果。如需要，可进一步做抗人球蛋白试验。结果判定、注意事项：同一步酶法。微柱凝集技术-按试剂说明书操作优点：可以自动化检测。操作简单、需要的样本少。灵敏度更高。试验重复性好。无需细胞洗涤步骤、对技术的依赖性降低。结果稳定易判读，结果可以保留较长时间供多人判读，还可以拍照永久保存。减少了试验人员接触样本的频率，减少接触感染的机会。缺点：特异性不如试管法。易受血浆蛋白、红细胞小凝块及抗原抗体复合物的干扰。对红细胞浓度要求高（0.8-1％）。抗体筛选的特异性不如试管法LISS-IAT，自身抗体会掩盖同时存在的同种抗体。可以检出临床无意义的抗体。自身对照自身对照：用患者自己的血浆+红细胞。自身对照无须作为抗体筛检的一部分。抗体筛选阳性，抗体鉴定时应设立患者自身细胞对照，这有助于识别高频抗原的抗体还是自身抗体。抗体筛选结果分析

分析抗体筛选阳性结果时，应综合运用以下资料：受检血浆与每个筛选细胞的反应结果。受检血浆与自身细胞的反应结果。

对照筛选细胞表，通过阴性排除法可初步看出可能有哪些抗体，再通过谱细胞做抗体鉴定，来确定抗体的特异性。筛选细胞表抗体筛选结果解释筛选细胞自身细胞解释+0同种抗体0+抗筛阴性+DAT阳性自身抗体++自身抗体同种抗体+DAT阳性自身抗体+同种抗体抗体鉴定结果分析

在分析反应结果、确定抗体特异性时，应综合运用以下资料：受检血浆与每个谱细胞的反应结果。受检血浆与自身红细胞的反应结果。检查和比较各个反应相的结果。阳性反应的强度，有无剂量效应。对照谱细胞表，通过阴性排除法来确定抗体的特异性。对自身红细胞上的抗原检查，从缺乏的抗原情况中，可提示存在相应的抗体。谱细胞表谱细胞表常见同种抗体的血清学特性对应抗体In-VitroHemolysis4C22C37CAHGCauses:HDNHTRAnti-DSomeMostMostYesYesAnti-CFewMostMostYesYesAnti-ESomeMostMostYesYesAnti-cRareMostMostYesYesAnti-eRareMostMostYesYesAnti-K0FewSomeMostYesYesAnti-k0FewFewMostYesYesAnti-JkaSomeFewFewMostMildYesAnti-JkbSomeFewFewMostMildYesAnti-Fya0RareRareMostYesYesAnti-Fyb0RareRareMostYesYesAnti-LeaSomeMostMostSomeManyNoFewAnti-LebRareMostMostFewSomeNoNoAnti-M0MostSomeFewFewFewFewAnti-N0MostFewOcc.Occ.RareNoAnti-S0FewSomeSomeMostYesYesAnti-s0NoFewFewMostYesYesAnti-P1Occ.MostSomeOccRareNoRareAnti-MiaSomeMostMostYesYesAnti-Dia0SomeSomeMostYesYes抗体筛选与鉴定1－同种抗体MP卡SI00（CCDee)SII+2+(ccDEE)SIII00(CCDee)(AC)00卡10(CCDee)20(CCDee)32+(ccDEE)40(Ccdee)51+s(ccdEe)60(ccdee)70(ccdee)80(CcDee)90(ccdee)100(ccdee)110(ccdee)S0000抗体筛选抗体鉴定结果(举例）：Anti-E（IgG)RH:CCDee配血：选择无cE抗原的红细胞，用卡或MP配血抗体筛选与鉴定2-同种抗体MP卡SI00（NN)SII+W+(MM)SIII+0(MN)AC00抗体筛选S02+1+0结果（举例）

:Anti-M（IgM）配血：S或MP；或者选择无M抗原红细胞，用卡配血。S卡DTTS/卡酶S/卡10（NN）00021+(MN)00032+(MM)W+0042+(MM)W+0051+(MN)00060(NN)00071+(MN)00080(NN)00092+(MM)W+00102+(MM)W+00110(NN)000抗体鉴定抗体筛选与鉴定3卡/MPSI+SII+SIII+AC抗体筛选（筛选细胞均阳性）可能原因1.单一同种抗体，与SI~SIII均反应2.多重同种抗体，与SI~SIII均反应3.冷自体抗体(+同种抗体?)4.温型自体抗体(+同种抗体?)抗体筛选与抗体鉴定(3-1)

－多重同种抗体MP卡SI+3+(CCDee）SII+3+(ccDEE)SIII+3+(CCDee)AC00抗体筛选S0000结果(举例):

Anti-C,-D,-E（IgG)配血：选择无CDE（ccdee)抗原的红细胞，用卡或MP配血。MP1+2+3+4+5+60708+90100110抗体鉴定S卡03+(CCDee)03+(CCDee)03+(ccDEE)02+(Ccdee)02+(ccdEe)00(ccdee)00(ccdee)03+(ccDee)00(ccdee)00(ccdee)00(ccdee)抗体筛选与鉴定(3-2)

－冷自体抗体(+同种抗体)MP卡SI+2+SII+2+SIII+2+AC+2+抗体筛选S2+2+2+1+结果

(举例):冷自身抗体+anti-E（IgG）Rh:CCDee配血：选择无cE抗原的红细胞，用盐水-IAT法配血MP1+2+3+4+5+6+7+8+9+10+11+抗体鉴定S37C60‘盐水-IAT2+002+002+01+2+002+01+2+002+002+002+002+002+00预温法抗体筛选与鉴定(3-3)

－温自体抗体(+同种抗体)MP卡SI+2+SII+2+SIII+2+AC+3+抗体筛选S0000结果

(举例):温自身抗体+anti-E（IgG）Rh:CCDee配血：选择无cE抗原的红细胞，盐水-IAT最弱反应红细胞。MP1+2+3+4+5+6+7+8+9+10+11+S盐水-IAT0w+0w+02+0w+02+0w+0w+0w+0w+0w+0w+抗体鉴定抗体筛选结果分析要点仅部分筛选细胞反应阳性？可鉴定出特异性的同种抗体反应强度一致？单一抗体或多重抗体发血及配血策略？红细胞的选择及交叉配血方法自体对照是否有阳性反应？同种或自体抗体阳性反应发生在哪一种方法？IgM或IgG抗体卡(MP)抗筛阳性后，应做盐水介质抗筛及自体对照，再选择抗体鉴定的方法优点：1.可分析抗体的性质（IgG或IgM）。

2.试管IAT可消除或减弱自身抗体及缗钱状反应的干扰。

3.不同反应介质的不同反应，有助于解决多重抗体或自体抗体合并同种抗体的复杂案例。抗体鉴定难题(1)抗筛结果(+)

自身对照(-)与谱细胞反应均(+)

或大部份谱细胞反应为(+)

反应介质与反应强度不一致与谱细胞反应均(+)

反应介质和反应强度一致疑为抗高频抗原的同种抗体疑为多重同种体抗体仔细分析可能的特异性，选择更多特定红细胞反应检测病人的红细胞抗原分型利用辅助方法协助特异性鉴定（酶、DTT、中和抑制法等）根据反应特性及病人种族，推测可能的特异性检测病人的红细胞抗原分型(请患者的兄弟姐妹前来采血检查)(送参比实验室鉴定)疑为自体抗体+同种抗体(少数案例可见呈现特异性的自体抗体)抗体鉴定难题(2)抗体筛选(+)

自身对照

(+)与谱细胞反应均(+)

反应介质与反应强度不一致与谱细胞反应均(+)

反应介质与反应强度一致疑为自体抗体(但仍须排除同种抗体的可能)以自身吸收(三个月内未输过血者)或异体吸收法，除去自身抗体，以检测同种抗体的存在。测试病人的红细胞抗原分型(Rh,Kidd……)，可辅助同种抗体特异性鉴定；给予表现型相同红细胞可防止同种抗体产生。直抗(+)※若为输血后血样，须小心排除为抗高频率抗原抗体的可能！红细胞抗原分型的难题患者近期有输血史用输血前的血样检测毛细管分离自身红细胞基因分型IgG或IgM包被红细胞IgM：温盐水洗涤、45℃热放散、DTT处理红细胞IgG：不影响IgM抗体试剂分型，影响IgG抗体试剂分型（二磷酸氯喹放散法）若输注单位不多，仔细观察是否有混合外观，仍可得到可信的分型结果吸收试验

自身吸收（冷、温自身抗体吸收）自身抗体会掩盖同种抗体。自身吸收后可以检测出同时存在的同种抗体。放散红细胞上的自身抗体，可以让出更多位置来吸附其他游离自身抗体。常用ZZAP处理红细胞近期内输过血的标本不适合作自身吸附法

异体吸收近期内输过血无法使用自体吸收法。异体吸收法最好使用三组血球R1R1Jk(a+,b-),R2R2Jk(a-,b+),rr,(也可加一组酶处理血细胞)异体吸收常用于：1.自体+异体抗体2.多重复杂抗体:单纯多重抗体,高频抗原抗体+其他抗体3.Anti-G,an