微生物限度检查方法适用性验证方案

目录.概述 第2页验证目的 第2页验证频次 第2页适用范围 第2页参照标准 第2页验证小组人员及职责 第2页.试验前准备 第3页验证所需的文件资料 第3页验证条件 第3页回收试验 第5页结果判断 第7页.概述验证目的进行产品的微生物计数检查时，应进行方法适用性试验（即微生物回收试验），以确认所采用的方法适合于微生物限度检查。本次验证的目的就是确认本法适合生产原料、初包装材料、一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查。验证频次建立生产原料、初包装材料一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查法时。检验方法更改时。原料、初包装材料、产品发生变化或检验程序发生改变时。适用范围生产原料、初包装材料、一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的微生物限度检查。参照标准2015版《中国药典》第四部通则。1.5验证小组人员及职责组长姓名部门/职务分工xxx总经理批准验证方案和报告，领导和组织验证工作组员xxx质量部负责人起草验证方案、收集整理数据，完成验证报告xxx技术部审核验证方案并实施，审核验证报告xxx质量部负责验证过程中的检测工作验证方案实施进程安排方案制定日期2017年 月 日实施日期2017年 月 日报告日期2017年 月 日

.验证前准备2.1验证所需的文件资料序号文件名称检查情况存放部门1培养基管理制度2检定菌种管理制度3微生物限度检验操作规程4手提式压力蒸汽灭菌器操作及维护保养规程6生物洁净安全柜操作及维护保养规程7微生物限度仪操作及维护保养规程8生化培养箱操作及维护保养规程9恒温怛湿培养箱操作及维护保养规程结论：验证： 日期：年月日 确认： 日期：年月日验证条件环境要求微生物计数检查在万级洁净区内的百级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区与工作台面必须进行洁净度验证。2.2.2验证所需主要仪器序号名称检查结果1手提式压力蒸汽灭菌器2生物洁净安全柜3微生物限度仪4生化培养箱5恒温怛湿培养箱结论：验证：日期：年月曰确认：日期：年月曰验证用培养基所有培养基均采用即用型培养基，临用时按使用说明使用。-表1-名称批号生产厂家沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)结论：验证： 日期：年月日 确认： 日期： 年月日验证用菌株：菌种来源( )-表2-名称代数接种日期传代保存培养基转种频次培养条件保存温度金黄色葡萄菌CMCC(B)26003TSA每月1次35℃/24-48h2-8℃铜绿假单胞菌CMCC(B)10104TSA每月1次35℃/24-48h2-8℃枯草芽抱杆菌CMCC(B)63501TSA每月1次35℃/24-48h2-8℃白色念珠菌CMCC(F)98001SDA每月1次25℃/2-7天2-8℃黑曲霉CMCC(F)98003SDA每月1次25℃/2-7天2-8℃结论：验证： 日期：年月日 确认： 日期：年月日2.2.5菌液制备-表3-

菌株名称菌株状态接种培养基培养条件稀释液稀释比稀释结果金黄色葡萄球菌工作菌株TSB30-35℃/18-24hPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1:10菌悬液每1ml含困量小于100cfu铜绿假单胞菌TSB30-35℃/18-24h枯草芽抱杆菌TSB30-35℃/18-24h白色念珠菌SDB20-25℃/24-48h黑曲霉SDB20-25℃/5-7天含0.05%(ml/ml)吐温80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液菌悬液每1ml含抱子数小于100cfu结论:验证： 日期： 年月日确认： 日期： 年月日接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生抱梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30s35℃培养18s24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养24s48小时，上述培养物用PH7.0无菌氟化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位)的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20~25℃培养5s7天，加入3s5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7无菌氟化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出抱子悬液至无菌试管内用含0.05%(ml/ml)聚山梨醋80pH7.0无菌氟化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氟化钠溶液制成每lml含抱子数小于100cfu的抱子悬液。菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2s8℃可在24小时内使用。黑曲霉抱子悬液可保存在28℃,在验证过的贮存期内使用。回收试验供试液制备根据原料、一次性妇用（壳聚糖）生物高分子止血吸附栓的理化特性和生物学特性，取供试品，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或0.9%的无菌氯化钠溶液，浸泡，振摇，制成1：10的供试液A。若需要，调节供试液pH值至6〜8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。根据初包装材料的理化特性和生物学特性，取供试品用开孔面积为20cm2的消毒过的金属板压在内层面上，将无菌棉签用氯化钠溶液沾湿，在板孔范围内擦抹5次，换1支棉签再擦抹5次，每个位置用2支棉签共擦抹10次，共擦抹5个位置100cm2。每支棉签擦抹完后立即剪断，投入盛有30ml氯化钠注射液的试管中，全部擦抹棉签投入后迅速摇晃1分钟，静置10分钟，即得供试液A。若需要，调节供试液PH值至6---8。必要时用同一稀释液将供试液进一步十倍系列稀释。接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性验证。试验组取供试液10ml,加入0.1ml试验菌液，混匀，制成供试液B。使每1ml供试液B中含菌量不大于100cfu。供试品对照组取供试液A10ml,加入0.1ml冲洗液代替试验菌液，混匀，制成供试液C。使每1ml供试液C中含菌量不大于100cfu。菌液对照组取冲洗液10ml代替供试液人，加入0.1ml试验菌液，混匀，制成供试液D。使每1ml供试液D中含菌量不大于100cfu。接种计数方法倾注法平板计数。取上述4种制备好的供试液各1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml(18ml)温度不超过45℃融化的TSA和SDA培养基，混匀，凝固，在规定的培养条件下倒置培养。阴性对照及空白对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照及空白对照试验，阴性对照及空白对照试验应无菌生长。如阴性对照及空白对照有菌生长，应进行偏差调查。