浅论乙烯雌酚诱导兔骨髓基质干细胞向成骨分化的实验研究

浅论乙烯雌酚诱导兔骨髓基质干细胞向成骨分化的实验研究【摘要】目的观察乙烯雌酚(Diethylstilbestrol)对兔骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)成骨分化的影响，探讨乙烯雌酚对骨髓基质干细胞的成骨调节及其对骨骼系统的影响。方法用不同浓度(0,10-10～10-5mol/L)乙烯雌酚干预1周龄新西兰长耳白兔的骨髓基质干细胞，并设地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C50mg/L为阳性对照，在干预不同时间分别用茜素红染色鉴定钙化结节形成、全自动生化仪测碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)活性。结果10-8mol/L乙烯雌酚干预25天后开始出现钙化结节;10-8、10-7mol/L乙烯雌酚干预组ALP在14、21天时显着增加。结论乙烯雌酚能促进兔骨髓基质干细胞的成骨分化，并能通过成骨细胞的数量来发挥骨骼系统的保护作用。

【关键词】乙烯雌酚;骨髓基质干细胞;成骨分化

Abstract:ObjectiveToobservetheeffectofdiethylstilbestrolontheosteogenicdifferentiationofrabbitbonemarrowstromalcellandtodiscusstheregulativeeffectofcoumestrolonbonemarrowstromalcells.MethodsThepresentstudyfirstlyintervenedBMSCsobtainedfrom1-week-oldNewZealandrabbitandpresentedDiethylstilbestrol(0,10-10～10-5mol/L),orDexamethasone10-8mol/L,β-SodiumGlycerophosphate10mmol/L,vitaminC50mg/Lforpositivecontrol.Then,Calciumnodeswereseenbychinalizarinstaining.Alkalinephosphatase(ALP)activitywaswasdetectedbyautomaticbiochemistryOsteogenicdifferentiation:BMSCsinducedtoosteogenesisformedmineralizednodularstructuresafter25daysin10-8mol/Ldiethylstilbestrolgroup，CellALPactivitywassignificantlyincreasedatthe14thand21thdayafterbeingtreatedwith10-8，10-7mol/Ldiethylstilbestrol.ConclusionsDiethylstilbestrolhasanenhancingeffectontheproliferationandosteogenicdifferentiationofbonemarrowstromalcells.

Keywords:diethylstilbestrol;bonemarrowstromalcells;osteogenicdifferentiation

目前，随着我国逐步进入老龄化社会,老年女性的骨质疏松等疾病的发病率明显上升，究其原因可能与年龄增长后体内激素含量降低有关。然而，激素替代疗法(Hormonereplacementtherapy，HRT)因激素带来的诸多的副作用，使其在绝经后老年妇女中的应用受到很大的限制。已有研究表明：食用富含植物雌激素食物的亚洲人，其乳腺癌、前列腺癌及骨质疏松症等疾病的发病率较白种人低。但是，雌激素骨髓基质干细胞(BMSCs)作用的报道很少。为观察雌激素对骨髓基质干细胞的直接作用，本实验拟通过用乙烯雌酚干预体外培养的兔骨髓基质干细胞，观察其对骨髓基质干细胞成骨分化的影响，初步探索雌激素对骨骼系统的作用及其作用机制。

1材料和方法

主要材料新西兰长耳白家兔(由辽宁医学院动物饲养中心提供)，LG-DMEM(低糖DMEM，GibcoBRL)，FBS(胎牛血清，杭州四季青)，全自动生化仪，茜素红试剂盒(北京科美东雅公司)，TRIzol(细胞裂解液，Katara)，胰酶、MTT(噻唑兰)、DMSO(二甲基亚砜)、Diethylstilbestrol(乙烯雌酚)，其余试剂均为国产分析纯。

细胞培养

提取BMSCs取1周龄新西兰长耳白家兔，将家兔拉颈处死，75%酒精浸泡10min，用碘伏消毒，之后无菌条件下取双侧股骨和胫骨，切除两端骨骺，显露骨髓腔。DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，用Percoll分离骨髓中的有核细胞，1000r/min离心5min，再用DMEM洗1次，收集BMSCs进行原代培养。

BMSCs原代培养取材成功后，将收集到的纯度较高的BMSCs重悬于含DMEM培养液中，并将细胞悬液以1×106/mL密度接种于50mL细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。原代培养过程中，分别在接种于细胞培养瓶后的8、16、24h和48h时用倒置显微镜对细胞的贴壁及生长情况进行观察。原代接种后48h进行首次半量换液。以后每隔3～4天全量换液1次。

BMSCs传代培养观察培养瓶中原代培养细胞密度，当细胞生长良好并细胞饱和度达85%～95%时进行细胞传代培养。首先弃去培养瓶中原有的DMEM培养液，用无菌PBS平衡盐溶液冲洗两遍。采用g/L胰酶1mL进行消化1min，待倒置显微镜下观察到细胞贴壁时的伪足回缩，弃去胰酶并加入3mLDMEM培养基，反复吹打充分分离贴附于培养瓶壁的细胞，按3×103个/cm2密度接种于新的细胞培养瓶中进行培养。之后每隔3～4天进行1次全量换液，并及时进行传代培养。

观察指标

倒置相差显微镜观察BMSCs细胞形态BMSCs细胞培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍摄照片。

钙化结节染色(茜素红染色)细胞消化后以×105个/mL接种于50mL细胞培养瓶，分组同上，干预第25天矿化结节形成后，PBS液冲洗2次，95%酒精固定10min，蒸馏水洗3次，%茜素红-Tris-HCl(pH)37℃，30min。蒸馏水冲洗，干燥，封片。显微镜下观察并拍照，矿化结节呈现桔红色。

ALP检测细胞消化后以×105个/mL接种于50mL细胞培养瓶，分组同上，每种浓度重复5瓶，干预7、14、21天后去掉培养上清，PBS清洗2次，加入%TritonX-100，反复吹打后，1000rpm离心3min，用全自动生化仪测上清液中ALP的含量。

统计学数据处理

实验结果所得数据采用SPSS统计学软件分析,数据以均值±标准差表示。多组间比较用单因素方差分析,两两比较用t检验，为差异有统计学意义。

2结果

倒置相差显微镜下观察BMSCs细胞形态骨髓细胞接种后，呈球形，悬浮于培养液中。8～10h开始逐渐贴壁，初期的贴壁细胞多为不规则形或短梭形，之后生长增快，形态也渐变为长梭形，约8天贴壁细胞长满85%～90%(图1a)，即可传代，传代后细胞生长速度加快。4代以前生长迅速，5～7天传代1次，细胞呈螺旋形生长(图1b)。5代以后增殖变慢，7～9天传代1次，诱导培养14～17天，细胞融合成单层，呈类圆形或多角形，类似成骨细胞形态(图1c);培养至25～27天可见矿化结节形成(图1d)。

钙化结节染色(茜素红染色)乙烯雌酚干预培养第25天，行茜素红染色，于10-8mol/L组细胞聚集的部位出现桔红色结节(图2a)。0浓度组未出现桔红色结节(图2b)。

ALP表达方差分析结果显示，干预培养7天，各组ALP无统计学差异。干预14天，10-8、10-7mol/L组显着增加ALP，其中10-7mol/L组促进最明显，显着高于地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C50mg/L组，10-5mol/L组显着抑制ALP，差别有统计学意义(001)。干预21天，10-8、10-7mol/L组显着增加ALP，其中10-7mol/L组促进最明显，显着高于10-8mol/L组和17β-E2组，10-5mol/L组显着抑制ALP(7天，n=5，;14天，n=5，001;21天，n=5，001)。表1不同浓度乙烯雌酚诱导后ALP表达的比较组别

3讨论

目前的已有研究证实雌激素具有促进成骨细胞的作用和抑制破骨细胞的作用[1]，而它对骨髓基质干细胞直接作用报道的很少。骨髓基质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，在某些特定条件下可以诱导分化为成骨细胞。因此，我们通过乙烯雌酚直接干预兔骨髓基质干细胞来研究其对BMSCs成骨分化的作用。

王斌等曾经对植物提取物香豆雌酚对骨髓基质干细胞的作用进行了实验研究，结果显示：10-8、10-7mol/L香豆雌酚均能显着促进大鼠骨髓基质干细胞的增殖，而10-5mol/L香豆雌酚在干预24、72h抑制细胞增殖;10-8mol/L香豆雌酚干预25天后开始出现钙化结节;10-8、10-7mol/L香豆雌酚干预组ALP在14、21天时显着增加、Hyp在28天时显着增加，10-8mol/L香豆雌酚干预组OC表达在28天时显着增加，高浓度(10-5mol/L)则呈现抑制作用;干预7、14天,10-7mol/L香豆雌酚能增加骨髓基质干细胞OPGmRNA及其蛋白的表达，提高OPG/RANKL基因的相对表达。由上述结果可知香豆雌酚能促进大鼠骨髓基质干细胞的增殖和成骨分化，并能通过影响OPG/RANKL的表达来发挥骨骼系统的保护作用。

同时，还有实验研究表明雌激素可以通过减少成骨细胞的调亡而增强成骨细胞的作用。唐孝明等研究发现脂多糖使成骨细胞Bax和Fas表达增强，而对Bcl-2的表达无明显影响;雌激素能抑制脂多糖增强成骨细胞Bax和Fas表达的作用，能使Bcl-2的表达明显增强，使Bcl-2/Bax比值增大从而抑制脂多糖诱导的大鼠成骨细胞凋亡。另外，雌激素还可能促进成骨细胞保护素基因的表达从而诱导骨髓基质干细胞的增殖和成骨分化。欧阳俊等在研究雌二醇和孕激素对人成骨细胞保护素基因的作用时发现17β-雌二醇能够促进人成骨细胞保护素基因的表达。而成骨细胞保护素可以促进骨髓基质干细胞的增殖和向成骨细胞分化。王金成等在研究不同细胞因子和激素对体外培养骨髓基质干细胞的影响的过程中发现，雌激素诱导产生的多种细胞因子都可以促进骨髓基质干细胞的增殖和成骨分化。由此可知，雌激素可以通过多种途径对骨髓基质干细胞的增殖和成骨分化起到促进作用。

综上所述，乙烯雌酚可能通过提高OPG/RANKL基因的相对表达，抑制成骨细胞的凋亡及促进产生多种细胞因子等途径来促进骨髓基质干细胞的增殖和向成骨细胞分化。这可为骨髓基质干细胞作为种子细胞来修复骨缺损提供理论基础。但雌激素对骨髓基质干细胞在体内的作用及如何降低雌激素对人体的副作用尚需进一步研究。

【参考文献】

1]KawashimaK，InoueT，TsutsumiN，etal.EffectofKCA-098onthefunctionofosteoblast-likecellsandtheformationofTRAP-positivemultinucleatedcellsinamousebonemarrowcellpopulation[J].BiochemicalPharmacology，1996,51(2):133-139.

王斌,吴小涛,韦继