浅论仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响

浅论仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响【摘要】目的：观察仙人掌对体外培养成纤维细胞增殖的影响及其量-效关系。方法：以小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)为研究对象，采用四氮唑盐(MTT)比色法测定仙人掌对成纤维细胞增生的影响(以OD值反映细胞活性)，采用免疫细胞化学染色法检测成纤维细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果：在一定浓度范围内(～mg/mL)，仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖，同时促进PCNA蛋白的表达，并随着仙人掌浓度的增加，成纤维细胞数量和PCNA蛋白的表达均不断增加，在mg/mL浓度时达到高峰，呈现明显的剂量-效应关系(r分别为，;P均)。结论：在一定浓度范围内，仙人掌具有促进体外培养成纤维细胞增殖的作用，并表现为明显的量-效关系。

【关键词】仙人掌;成纤维细胞;增殖

Abstract:Objective:ToexploretheeffectsofOpuntiaonfibroblastproliferationinvitroanditsconcentration-effectrelationship.Methods:TheeffectsofOpuntiaonproliferationoffibroblastweremeasuredwithMTTcolorimetricassay，andPCNAproductionswereexaminedwithimmunocytechemistry.Results:OpuntiacouldprovokefibroblastproliferationandincreasePCNAproteinexpressioninconcentrationrange～mg/mL.Furthermore，theeffectsexhibitedasignificantconcentration-dependentrelationship(r=，respectively，P).Conclusion:Opuntiacanprovokefibroblastproliferationwithinacertainconcentrationrange，whichexhibitsasignificantconcentration-effectrelationship.

Keywords:Opuntia;fibroblast;proliferation

仙人掌(Opuntia)，又名神仙掌、老鸦舌、观音掌等，已经被用来治疗糖尿病、溃疡等症[1-2]。仙人掌治疗胃溃疡的机制可能与成纤维细胞的增殖有关。近几年来，虽然仙人掌的药理作用已成为医学热门研究方向，但有关仙人掌对体外培养的成纤维细胞增殖的影响未见报道。本研究以体外培养成纤维细胞为实验对象，观察仙人掌对成纤维细胞生长增殖的影响及其量-效关系。

1材料和方法

材料小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)购自上海肯强仪器有限公司，鼠抗人PCNA单克隆抗体及其他试剂均购自武汉博士德生物有限公司。仙人掌干粉为鲜茎片80℃烘干制成，由福州日冕科技开发有限公司生产提供。

方法

药物处理：将仙人掌粉溶于80℃左右蒸馏水中，制成不同浓度溶液，经1500r/min离心5min，取上清液，调节pH值为～，高压蒸汽灭菌20min，冰箱中(-18℃)保存备用。

采用四氮唑盐(MTT)比色法测定仙人掌对成纤维细胞增殖的影响：取NIH3T3对数生长期细胞常规消化，调整细胞为5×104个/mL，以每孔104个细胞密度接种于96孔培养板中，37℃、5%CO2条件下培养。细胞贴壁后随机分成6组，第1组只加入无血清DMEM50μL作为空白对照组;2～6组加入等量的用无血清DMEM配制的仙人掌干粉液，浓度分别为：、、、、1mg/mL。37℃5%CO2条件下培养48h，吸出培养液，各孔加入20μL的MTT液(以不含血清的DMEM高糖培养基配置，浓度为5mg/mL)，继续培养4h，小心吸弃培养液，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使结晶物充分溶解。应用酶标仪490nm处测定各孔的吸光值(OD值)。

免疫细胞化学技术测定仙人掌对成纤维细胞表达增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)的影响：将NIH3T3细胞接种于含玻片的12孔板中培养24h，细胞贴壁后第1组只加无血清DMEM作为空白对照组;第2～第6组加入等量的用无血清DMEM配制的仙人掌干粉液，浓度分别为、、、、1mg/mL。培养48h后撤药，加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM液继续培养24h，取出长有细胞的玻片固定，用鼠抗人细胞PCNA单克隆抗体作第一抗体，SABC法行免疫细胞化学染色。显微镜(×400)下计数100个细胞数，计算阳性细胞(棕黄色染色)数占细胞总数的比率。具体操作过程严格按试剂盒说明书进行。

同时设空白对照试验：用PBS代替一抗，余步骤同上。

统计学处理方法组间比较用One-WayANOVA分析后，采用Student-Newman-Keuls检验。相关分析采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。

2结果

仙人掌对成纤维细胞增殖的影响在一定浓度范围内(～mg/mL)，仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖，在mg/mL浓度时达到高峰，并随着仙人掌浓度的增加，成纤维细胞数量也不断增加，表现为明显的剂量-效应关系(r为，P)。但是当仙人掌浓度达到1mg/mL时，不影响成纤维细胞生长增殖，见表1。

免疫细胞化学技术测定仙人掌对成纤维细胞表达PCNA的影响一定浓度范围内(～mg/mL)的仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞PCNA蛋白的表达，在mg/mL浓度时达到高峰，并表现为明显的剂量-效应关系，即随着仙人掌浓度的增加，其表达量不断增加(r为，P)。但是当仙人掌浓度达到1mg/mL时，不影响PCNA蛋白的表达，见表2。

3讨论

仙人掌作为天然中草药，具有作用范围广、副作用小等优点，其化学成分复杂，含有有机酸类、甾醇类、黄酮类、生物碱类、糖类和萜类。其中的黄酮含量较高，且主要以芦丁和槲皮素为主，干物质中总量达到了%，其中芦丁含量达%，槲皮素含量达%。芦丁、槲皮素具有维持毛细血管通透性，防止血细胞凝集，降血脂，抗氧化等多种生物活性;仙人掌还富含钾、钙、铜、铁、锰、锌等营养元素及果胶。仙人掌的药用价值最先记载于清代赵学敏所着的《本草纲目拾遗》中，其功能有行气活血、清热解毒、消肿止痛、健脾止泻、安神利尿，可内服、外用治疗多种疾病。近几十年国内外的研究表明，仙人掌提取液具有抑菌、降血糖、降血压、抗肿瘤、提高免疫机能等多种药理作用。

成纤维细胞是创伤修复最主要的细胞。创伤后，成纤维细胞发生增殖、迁移，并合成、分泌胶原蛋白和细胞外基质(蛋白质和蛋白多糖)成分，参与肉芽组织形成、创口收缩及组织重建的过程，其数量变化会对创伤愈合产生巨大影响。本研究表明，在一定浓度范围内(～mg/mL)，仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖，并表现为明显的量-效关系，即随着仙人掌浓度的增加，成纤维细胞数量也不断增加，在mg/mL时达到高峰。增殖细胞核抗原(PCNA)亦名细胞周期蛋白，是与细胞周期相关的核蛋白，它被认为是真核细胞内DNA聚合酶δ的一种辅助蛋白。PCNA直接参与DNA的合成，在静止期细胞内含量很低，自G1晚期逐渐增加，到S期其量达到高峰。PCNA的免疫定位已成为检测细胞增殖活性最有效的标志之一[8-9]。在本实验中，一定浓度范围内(～mg/mL)的仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞PCNA蛋白的表达量，并表现为成纤维细胞增殖一致的量-效关系，在mg/mL浓度时亦达到高峰，表明仙人掌在一定浓度范围内可以促进机体合成PCNA，加快细胞的增殖。

但有研究报道，在活体实验中，仙人掌提取物具有降低兔耳腹侧增生性瘢痕组织块中Ⅰ型胶原蛋白表达，促进Ⅲ型胶原蛋白表达;同时使基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达升高，加速Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的降解，从而减轻瘢痕增生，促使已形成的增生性瘢痕组织块软化、吸收[10]。我们在本研究中也发现，当仙人掌浓度达到1mg/mL时，将不影响成纤维细胞生长增殖和PCNA蛋白的表达，但未发现其抑制作用。

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