杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取

杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取【摘要】目的研究杜鹃花叶片总RNA的提取方法。方法一种适合富含次生代谢产物的杜鹃花叶片总RNA的提取方法——改良CTAB法。采用CTAB作为去污剂，分别用氯仿和水饱和酚反复抽提以及高浓度NaCl沉淀，以去除蛋白质、多糖和次生代谢物等杂质，最后用无水乙醇沉淀获得总RNA。结果该方法不仅使所获得的总RNA完整性好，纯度高，而且操作简单、快速、成本低廉。结论该方法对杜鹃花等富含次生代谢产物的植物特别是富含多酚、多糖的材料的总RNA提取具有借鉴意义。

【关键词】RNA提取；杜鹃花；改良CTAB法

ChinaAbstract：ObjectiveTostudythemethodforisolationoftotalRNAfromRhododendronleaf.MethodsAnimprovedCTABmethodwaspresentedheretobesuitableforisolationoftotalRNAfromRhododendronleaf,aplantwhichcontainedabundantsecondarymetabolites.UsingchemicalCTABasdetergentintheextractionbuffer,theabsoluteethanolprecipitationofRNAwasperformedfinallyafterremovingofprotns,polysaccharides,andsecondarymetabolitesbysubsequentchloroform,H2O-saturatedphenolextractionandhighconcentrationNaClprecipitation,yieldedtotalRNAhadintegralityandhighpuritybut.ConclusionThemethodmaybeappliedtosomedifficultRNAextractionplantsfullofpolyphenolandpolysaccharides,particularlyRhododendron.

Keywords：RNAextraction;Rhododendron;ImprovedCTABMethod

杜鹃花叶片中的蛋白质、多糖、多酚等次生物质含量多且复杂，严重影响了其RNA的提取质量，从而给此类植物的基因工程研究带来了诸多阻碍。由于多糖类胶状物质会严重堵塞过滤柱，所以即使使用商业提取试剂盒也不能得到高质量的RNA；另外，这类次生代谢物含量多的材料，市售的RNA提取试剂的针对性也不强，不仅操作麻烦费时，而且很难同时解决RNA的质量和得率问题。虽然目前已建立了很多针对富含多糖多酚材料的RNA提取方法［1～5］，但还没有以杜鹃花为材料提取RNA的报道。因此，本实验以杜鹃花叶片为材料，借鉴CTAB法［6］并进行了改良，提出一套适合提取杜鹃花叶片总RNA方法。

1材料与仪器

试剂与仪器提取液配方：2%CTAB(W/V)，4%PVP(W/V)，100mmol·L-1Tris-HCl()，25mmol·L-1EDTA(pH)，5mol·L-1NaCl，混匀灭菌121℃，15min，灭菌后加入体积分数2%的2-硫基乙醇。DEPC购自Amresco公司；琼脂糖购自Sigma公司；rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa有限公司；引物由Invitrogen公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

冷冻离心机：Centrifuge5804R(Eppendorf公司)；电泳仪：DYY-Ⅲ1型稳压仪(北京六一仪器厂)；紫外凝胶成像系统：BioIMAGINGSYSTEM(SYNGENE)；紫外可见分光光度计：TU-1800(北京普析通用仪器有限责任公司)；PCR仪：Personalcycler(Biometra公司)。

材料多年生杜鹃花叶片采自龙池华西亚高山杜鹃园，采下后立即用液氮浇淋，于-70℃贮存备用。

2方法

几种试剂盒法提取杜鹃花叶片总RNARNAplant试剂提取法：试剂购自TIANGEN公司，实验操作按照说明书进行；TRIReagent试剂提取法：试剂购自Ambion公司，实验操作按照说明书进行；RNeasyPlantMiniKit试剂提取法：试剂购自QIAGEN公司，试验操作按照说明书进行。

改良CTAB法提取程序：①称取100mg的杜鹃花叶片，迅速放入液氮研磨至粉末状，转入ml离心管内，加入65℃预热的提取液，涡旋振荡混匀后65℃温浴20min。②加入与提取液等体积的水饱和酚，振荡摇匀，4℃12000r·min-1离心10min。③上清转入新的无RNase离心管；加入与提取液等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，4℃，12000r·min-1离心10min。④吸上清装入新的离心管里，加入1/2上清体积5mol·L-1NaCl，摇晃混匀，再加入1/2体积氯仿，振荡混匀，4℃，12000r·min-1离心10min。⑤上清液转入新的无RNase离心管并加入等体积的异丙醇，温和混匀后室温放置10min，4℃12000r·min-1离心10min，小心倒掉上清液；加入1ml70%乙醇，4℃12000r·min-1离心1min，小心倒掉上清液；加入30～50μlDEPC处理水溶解沉淀。⑥加入DNaseI(10U·μl-1)1μl混匀，37℃温浴30min。⑦加入100μlDEPC处理水稀释后，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，4℃，12000r·min-1离心10min。⑧吸上清液，加入1ml无水乙醇，-20℃静置2h。⑨4℃，12000r·min-1离心5min弃上清液，用70%的乙醇洗涤。⑩4℃，12000r·min-1离心10min弃上清，干燥后加入20μlDEPC处理水保存备用。

RNA完整性与质量检测使用各种方法提取时，样品的起始量均为100mg，得到的RNA样品都稀释10倍后取1μl进行非变性琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统中观察提取的RNA完整性。取1μl样品，稀释50倍，紫外分光光度计测量其在230nm，260nm，280nm处的紫外吸光值(A)。计算A260nm/A280nm，A260nm/A230nm用于纯度分析。

RT-PCR按TaKaRa公司AMV反转录酶操作手册进行。合成一对克隆18SrRNA序列的引物18SA(5‘-CAACCATAAACGATGCCGACC-3‘)和18SB(5‘-CAGCCTTGCGACCATACTCCC-3‘)，以反转录产物为进行PCR扩增。扩增条件为94℃5min；94℃40s→63℃40s→72℃90s，30个循环；72℃7min。%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

杜鹃花hsp70基因cDNA片段的克隆根据已知植物hsp70基因核甘酸序列的保守区域设计合成下述4个正向或反向简并引物做巢式PCR。外测为C1:5‘-GGNATHGAYYTNGGNACN-3‘，C2:5‘-NCCNGCRTCYTTNGTNGC-3‘；内测为D1:5‘-GAYCARGGNAAYMGNACNACNCC-3‘，D2:5‘-RTCRTTRAARTANGCNGGNAC-3‘。预期PCR产物片段大小为350bp左右。以上述cDNA为模板，用TaqDNA聚合酶进行巢式PCR扩增，以引物C1，C2进行巢式PCR的首轮扩增，反应体系为cDNA1μl、10×PCR缓冲液(无Mg2+)2μl、dNTP(mmol·L-1)μl、rTaq酶μl(2U·L-1)，以及C1、C2(100mol·L-1)各1μl，Mg2+μl，加ddH2O至20μl。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃50s，49℃50s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取首次扩增产物1μl，稀释20倍作为第2轮扩增的模板，用引物D1、D2进行巢式PCR的第二轮扩增，反应体系与巢式PCR的首轮扩增相同,扩增条件为：94℃预变性5min，94℃50s，50℃50s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

3结果

RNA完整性分析通过琼脂糖凝胶电泳可以直观地看到，改良CTAB法提取的杜鹃花叶片总RNA，条带清晰，完整，不拖尾(泳道1，2)，说明在该方法中RNA很少降解。而RNAplant试剂提取的RNA(泳道3，4)，在初始加入材料量相同的情况下，条带较暗也就是得率较低。而TRIReagent试剂盒和RNeasyPlantMiniKit试剂盒均未能提取得到杜鹃花叶片总RNA。

RNA完整性分析及质量检测用紫外分光光度计测量改良CTAB法得到的RNA样品的A260nm、A280nm和A230nm值。经过多次实验的结果计算，A260/A280平均约为，A260/A230平均约为。A260/A280和A260/A230比值均在许可范围内。在RNA得率方面，用100mg鲜重的起始材料，可得到20μg左右的总RNA。

PCR验证以改良CTAB法提取的RNA进行反转录产物为，用18SA，18SB为引物进行PCR。实验结果表明，能成功地扩增出长度为110bp左右的目的片段。这进一步说明本实验法提取的RNA样品完整，可以用于后续试验(见图2)。

杜鹃花hsp70基因cDNA片段的扩增采用简并引物C1和C2进行巢式PCR第1轮扩增仅得到模糊的条带，进一步采用内侧锚定简并引物D1和D2进行巢式PCR的第2轮扩增到1条约350bp的DNA片段，与预计的目的片段相似。回收后克隆至pMD18-T载体(TaKaRa)，转化感受态DH5α，利用D1、D2引物，将通过菌落PCR反应检测得到阳性克隆进行测序，得到366bp的cDNA片段。测序后通过NCBI上的BLAST工具分析，证实为hsp70基因序列。

4讨论

能否有效抑制RNase，去除多糖、酚叶片中含有大量的多酚，多糖，对RNA的提取方法提出了更高的要求。本实验采用CTAB(十六烷基溴化三甲胺)裂解植物材料，与细胞中的核酸形成核酸-CTAB复合体，这类复合物沉淀的时候将蛋白、多糖、色素以及多酚类化合物与核酸分离开来。利用水饱和酚可以部分去除DNA，获得DNA残留极少的RNA，减少DNA污染；同时，由于水饱和酚的加入，提高了去除蛋白质的效率，使得氯仿抽提次数在提取过程中减少，本实验中只需再进行一次氯仿：异戊醇抽提，就能使有机相与水相的界面清亮，彻底去除蛋白，避免了反复操作。

近年来已有关于去除植物多糖和酚类物质的相关报道，但不同植物或同一植物的不同品种往往因种属差异，材料组织内多糖或多酚的组分和含量有很大不同，所以需要采用不同的RNA提取方法。有研究表明，在高浓度Na+或K+的存在条件下，通过氯仿抽提可以去除一些多糖，经过本实验确定，与高浓度的KAc相比，高浓度的NaCl去除样品中多糖的效果更好，从而建立了有效提取样品RNA的方案。与传统CTAB法相比，本实验减少了用LiCl选择性沉淀RNA过夜的步骤，改为分级去除杂质，节省了试验时间，有利于减少RNA的降解和损耗，提高了样品的质量。

RNAplant试剂对于杜鹃花这种多酚，多糖含量都很高的材料，效果一般，可能多糖形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来［7］。本实验所用的药品、试剂都较为常用，采用该方法能在一天内完成RNA的提取，并得到质量很高的产品，相比购买市售的RNA提取试剂盒或传统CTAB法，具有花费少、易操作、耗时短、成效高的优点。

【参考文献】

1］张玉进，孟祥春，潘瑞炽，等.非洲菊花瓣总RNA提取方法的改进［J］.植物学通报,2001,18(6):722.

［2］张今今，王跃进，王西平，等.葡萄总RNA提取方法的研究［J］.果树学报，2003，20(3):178.

［3］侯义龙，张开春，吴禄平，等.果树组织中总RNA提取的新方法［J］.沈阳大学学报,2002,33(2):122.

［4］A.daSilvaGestra,F.Micheli,C.FortesFerrra.IsolationandpurifcationoffunctionaltotalRNAfromdiverseorgansofcacaotreeduringitsinteractionwiththepathogenCrinipillisperniciosa［J］.BioTechniques,2003,35:495.

［5］JackolaL,Pirttila,HalonenM,etal.Isolatio