生物文献翻译-来自凋亡血小板中的微粒能够促进巨噬细胞的分化

来自凋亡血小板中的微粒能够促进巨噬细胞的分化血小板释放出的微粒不仅是活化的，而且像细胞凋亡一样处于老化状态（apoptosis-inducedplateletmicroparticles,PMap）。虽然诱发活化的微粒已经被广泛的研究，但是关于其PM叩构造形成的生理学影响目前还不被了解。流式细胞术和扫描电镜表明PMap呈现激活整合蛋白和影响微粒聚合形成的作用。PMap对单核细胞具有趋化现象，能够束缚于这些细胞，此外能够刺激细胞粘附和附着于纤粘连蛋白表面。在持久的潜伏之后，PMaDap能够促进细胞的分化，但抑制细胞的增殖。单核细胞膜受体分析显示增加了CD11b（integrinaMb2），CD14和CD31（plateletendothelialcelladhesionmolecule-1）的表达水平，和趋化因子受体CCR5和CXCR4的表达水平，但是CCR2没有变化。这表明PM叩能够将细胞趋极化驻留在M2单核细胞上。应对PM叩的细胞积极消耗氧化低密度脂蛋白（oxLDL），并释放蛋白酶和过氧化氢。进一步证实发现分化朝向PM叩刺激（ox）LDL受体，CD36和CD68,炎症细胞因子和单核细胞产生的免疫调节因子等定向专有吞噬细胞方向。总之，PM叩与单核细胞之间的相互作用具有一种免疫调节的可能性。这种细胞凋亡微粒能够使细胞向驻留M2子集方向极化，并且导致朝定向专性吞噬细胞方向进化。在富含血小板的血浆中微粒的存在早在60年代已经被发现了，这些之前被称为血小板尘埃。从那时起，在血栓形成和止血生理途径中由血小板导出的微粒所扮演的角色已经被较好的确定下来。在正常的外周血也中循环流动的血小板微粒支持低水平的凝血酶的产生。在外科手术之后和血栓形成的条件下，在血浆中的微粒水平显著增加，而且这与心血管疾病、炎症和动脉粥样硬化的病理学作用有关。这些微粒的形成被认为是用强有效的激活剂激活血小板而产生的结果，在体外用一种强效促凝血电位刺激会引起被激活的微粒大量脱离流失。血液中血小板的循环周期是9-10天，而且被脾脏清除或者是经历一种像细胞凋亡一样的过程。这种由时间诱发的血小板细胞凋亡也导致微粒的流失，但是显然，这个过程不存在血小板激活信号。因此，在血液中随着年龄的增加存在一种PMap（apoptosis-inducedplateletmicroparticles）的持续形成，表面上看似是一些沉默了的血小板。吞噬细胞，包括单核白细胞，树突状细胞和巨噬细胞，负责细胞凋亡血小板的清除工作和在循环中PMap的清除工作。条件性的刺激血小板细胞凋亡或者吞噬作用的抑制今后也将增加血浆中PMap的水平，将加剧与炎症有关的疾病发生像动脉粥样硬化。很多已经注意到激活血小板产生的微粒。例如，他们具有高水平促凝血的潜能特点，他们具有许多生物学活性的蛋白质组——包括CCL5,CXCL4和CXCL7——这些都已经被阐明而且他们近来发现能够提高血管原的早期分支细胞的瓦萨再生能力。相反的是，很少有相关的知识是关于自然形成的诱导细胞凋亡的微粒,PMap的生物学效应。这里，我们假设PMap在与白血球相互作用中，特别是单核细胞的作用中起到免疫调节剂的角色。我们的目的是通过描述PMap和单核细胞及原单核细胞之间长期和短期的相互作用来确定PMap。结果单核细胞与PMap的相互作用包含微粒而不含血小板的血浆与含有血小板，没有通过血小板活化作用、仅仅依靠时间而流出细胞凋亡的微粒（图1，左面）的血浆浓缩液分离（储存5天），可使用作为血小板特有的细胞标记CD61（glycoprotein（GP）Ilia表达利用流式细胞术直观的观察结果（图1，右图）。用显微镜观察血浆中PMap的存在和完整血小板的缺失。利用微孔过滤（0.8mm）和超速离心的方法相结合移除完整的血小板，PMap被分离出来并且以流式细胞术为特点，与新鲜孤立的血小板作为参照。PMap部分主要包含＜1mm的部分，但也有一定数量的较大尺寸部分（图1b）。这些较大的部分可能是聚合的PMap，这些较大的部分可通过扫描电子显微镜来显示单一或者聚集微粒的存在（图1c）。流式细胞术进一步表明CD61在PMap中的表达水平要比休眠的血小板中要低（匹配不同尺寸），并且活化的GPIIb/IIIa（检测PAC1单克隆抗体）在Pmap中要高（图1d和e）。在Pmap中强效激活标记物的表达，例如，CD62P（P-selectin）和磷脂酰丝氨酸（annexinA5binding），与休眠体血小板相比是增加的。同时，这表明Pmap呈现了一种促凝血磷脂质的激活状态和活化整合蛋白，从而解释了他们能够形成聚集体的能力。然后我们检测了PMap捆绑THP-1细胞的能力，建立了单核细胞系。电子显微镜检测共孵育微粒THP-1细胞表面的多个PMap（图2a）。流式细胞术使用抗CD61mAb表明捆绑于细胞上的PMap在30分钟和70分钟之间增加了（图2b和c）。在之后的时间里，在细胞表面的CD61结合位点又减少了。这表明PMap通过内吞作用进入细胞了，通过共聚焦显微镜观察揭示PMap位于THP-1细胞的表面和胞质中（图2d和支持论点的电影）。在热处理PMap之后（56°C30分钟，数据未提供），捆绑结合完全消失，表明PMap表面的活性粘附因子与单核细胞相互作用是必要的。为了确定PMap是否包含对血液细胞的生物活性，我们使用磷酸酯膜迁移实验来探索其在THP-1细胞中的区划性。引人注意的是，与参照趋化因子CCL2（图2e）相比，PMap能够引起健康细胞的迁移，这表明微粒具有强烈的趋化潜力。为了进一步确认来自PMap的电位介体，我们采用了CCL5和CXCL7的抑制性抗体，这两种血小板衍生趋化因子表明了tomediate单核细胞的补充。THP-1细胞对PMap的趋化性能够有效地被CCL5的抗体所阻遏，然而CXCL7抗体或者同型抗体却没任何影响（图2e）。这就表明CCL5是介导单核细胞朝PMap方向迁移的主要因素。在静态和动态状态下单核细胞诱导PMap的粘附。通过实验表明单核细胞与PMap的功能交互影响。具有PMap（44小时）的THP-1细胞预培养导致了显著的增加一一在静态条件下对纤连蛋白表面稳固的粘附。这种效果对PMA潜伏具有同样的影响（图3a）。它通常会增加PMap更高的数值，然而PMap制剂的上清液是不活跃的。而且，静态血小板的预培养，增加了相似的数值，并不会影响粘附力。作为血小板自发流出的PMap，即PMap的第一代，在静态血小板共孵育实验过程中可能影响我们的发现（图1a）。为了排除这些自发产生的PMap的潜在影响，我们首先确定在7天之后PMap形成的数量，相对于我们在实验中通常使用的PMap数量的10/1（图3b）。在asubsequent粘附试验中，我们将10/1比例的PMap和自然释放的PMap的功能影响进行比较。正如所预料的那样，微小数量的PMap是不会存在任何影响的（图3c）。PMap在主要细胞的粘附方面的影响被研究了在生理条件下低剪切力对人类内皮细胞单层汇合的影响。PMap的共孵育（44小时）戏剧性地刺激了分离的单核细胞对内皮的粘附，然而在相似条件下与血小板的共孵育却没影响（图3d）。因此PMap治疗对单核细胞系和原始单核细胞的粘附性起刺激作用。PMap对专性定位吞噬细胞的诱导分化。在短期或者长期与或者不与PMap共孵育之后通过流式细胞术技术研究单核细胞表面受体的变化。PMap的存在渐渐地增加了CD11b，CD14和CD31的表达水平，以相似的方式对THP-1细胞和原始单核细胞处理（图4b）。在44小时之后，PMap的存在对THP-1细胞和单核细胞内CCR2表达水平起抑制作用，尽管这种受体的表达在7天之后恢复了。相比之下，在THP-1细胞中PMap能够显著的增加CCR5的水平，但是在原始单核细胞中这种促进是不存在的，而且在THP-1细胞和原始单核细胞中能够增加CXCR4水平（图4a和b）。这个共同点表明PMap治疗单核细胞趋向于承担M2单核细胞表型，这一点以前解释为CD14+CD16+CCR2+CCR5+CXCR4++。CD16的表达水平在我们的实验中仍然没有改变（图4a和b）。具有PMap的THP-1细胞较长的潜伏刺激纤连蛋白在细胞表面的蔓延（图5a）。涉及filopods和lamellipods形成的传播，作为肌动蛋白丝与着色的肌动蛋白探针、鬼笔环肽结合（图5a）。同时也发现PMap的出现本质上废除了THP-1细胞的扩散增殖（图5b）。控制漠化乙锭的着色表明在经过PMA、pmap或者休眠血小板处理之后有大概6%-7%的坏死细胞存在（图5c）。总的来说，这些发现支持这样的结论——在PMap存在的情况下THP-1发展成一个稳定的，没有增殖的吞噬作用表型。进一步实验确定了向专性吞噬细胞分化。延长时间，用PMap处理THP-1细胞7天潜伏，但是没有休眠血小板的存在，增加了氧化低密度脂蛋白的吸收（oxDL；图5d）。与此相同的是，在PMap存在的条件下oxDL和LDL的受体CD36和CD68的表面表达是增加的（图5e）。同样，用PMap处理7天的初级单核细胞的潜伏增加了CD36的水平，但是这一时期似乎太短而不能改变CD68的表达（图5e）。单核细胞诱发PMap分泌特性。稳定的吞噬性单核细胞具有能够分泌降解的基质蛋白原和活性氧的能力。事实上，用PMap处理的THP-1细胞的孵化，但不是休眠期血小板，2-7天导致了功能性MMP9的产生，正如酶谱法所展示的那样（图6a）。酶谱法的量化表明在PMap孵育之后MMP活性随时间而增加，7天之后用PMA孵育的效果是相似的（图6b）。这次结果也表明MMP是由PMap衍生而来的而且血小板本身不可视的对上清液zymographic的活性的作用。此外，PMap的孵育明显地增加了来自单核细胞（图6c）和初级单核细胞（图6d）H2O2的释放。针对细胞激素和趋化因子分泌物的筛选，初级单核细胞用PMap或者休眠血小板培养44小时，随后用半定量矩阵分析了细胞上清液细胞因子在平皿上的位置（图7a）。明显的是，与血小板相比较，PMap的出现刺激了几个因子和其他因素的释放，如C5a，CCL5和白细胞介素-23，和巨噬细胞迁移抑制因子，可溶性CD40配基和可溶性细胞间粘附因子的小程度释放。此外，单核细胞产生了几个参与immunomodulating和regenerative过程的因素而不是炎症，例如G-CSF和GM-CSF。用一种更多定量方式确定相关细胞因子的分泌，我们做了C5a，GM-CSF，IFN-g和TNFa的酶联免疫吸附测定。尽管IFN-g的分泌水平低于检测范围，通过PMap，酶联免疫吸附测定能够最大限度的确定单核细胞C5a，GM-CSF和TNFa分泌的感应，即使与PMap相比血小板能够最大限度的增加GM-CSF的表达（图7b）。讨论在本文中，我们确定了PMap在单核细胞功能方面的强有力调节作用。这些微粒，在一个累死细胞凋亡的过程中由衰老血小板形成的，似乎显示了一个特有的“不干粘合剂”膜表面，（GPllb/llla）附着激活的整合素和暴露磷脂酰丝氨酸，这可能会促进单核细胞的相互作用与整合。在文献中，血小板白血球coaggregate的形成被广泛研究，例如，血小板激活的蛋白酶受体（凝血酶受体）和P2Y12受体的激活。非常少，但是，仍然被广泛了解的是血小板微粒白细胞复合物的形成。本研究是首次证明血小板微粒的作用，白细胞产生的老化和凋亡的血小板的功能与分化。联合我们的结果表明，与单核细胞和初级单核细胞相互作用的PMAP能够唤起细胞极化和分化的潜能。在我们的应用模型中血小板微粒和体外单核细胞的PMap，我们努力排除血小板在PMap混杂的长期共培养过程中所产生的影响。事实上，由血小板自发产生的PMap被发现其功能是微乎其微的。精确地信号途径，由PMap单核细胞触发的途径仍需要确定。一个可以想象的机制，支持我们的研究结果的是，引起通过趋化因子例如CCL5，保持和分泌活化的血小板和活化诱导的血小板微粒进行的。这种机制解释了PMap导致的单核细胞迁移的趋药性和最近一直被暗示通过血小板的作用调控T细胞的分化。此外，PMap诱导的单核细胞的激活可能依赖于微粒表面受体的特定分子之间的相互作用，包括血脂（磷脂酰丝氨酸），胶黏剂，激活受体（例如GPllb和llla受体）和GP反受体（P-选择素）确认为与血小板单核细胞活化相似。此外，在黏着作用下地PMap的内吞作用可能迫使单核细胞进入特异性的分化途径。有趣的是，呈现出PMap诱发的单核细胞的粘附被青霉素废除，暗示了磷酸肌醇-3-激酶信号通路在单核细胞活化中的作用（E.Vasina,未公布数据和巴里等）。循环的单核细胞呈现了一种不同子集的离散的性质和功能。一个传统的分工是“促炎”M1单核细胞分泌炎性细胞因子和细胞毒作用，和“定居”M2单核细胞，参与组织重构，伤口愈合及血管生成。M2单核细胞通过强有力的endocytotic的活性分化为特定的专性吞噬细胞。得知定居单核细胞的形成是伴随着CCR2的下调以及CCR5和CXCR4表面受体的上调，我们观察到PMap分化为M2细胞和专性吞噬细胞的一个标志性潜能。这点证实了胶黏剂整合表达的增加（CD11b），各自的低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白受体，CD68和CD36。和较高的氧化低密度脂蛋白的摄取。进一步支持了这种概念，M2单核细胞优先分化为树突状的细胞，我们发现PMap刺激的单核细胞导致的GM-CSF数目的提高。目前的研究结果可能对我们理解动脉粥样硬化的病理有重要影响。初步支持在流动状态下PMap激活的单核细胞增强对内皮细胞的附着力上，优于血小板渗透，特别是在动脉粥样硬化的早期阶段有关系。这增加的附着力可能是通过微粒上得受体介导的或者是通过粘合剂单核细胞受体的表达增加所致（例如，CD11b，CD31）以及可能是由于趋化因子表达扩增所致例如CCL5。此外，单核细胞子集LyCloCCR2CCR5p被发现是使用CCL5受体CCR5当进入小鼠的动脉粥样硬化斑块的时候，并且在几项研究中发现CCR5的阻塞导致了动脉粥样硬化的减少。类似地，在我们的实验中，通过PMap介导的CD14PCD16Pccr5Pcxcr4pp表型的人单核细胞的极化作用暗示形成了一个proatherogenic单核细胞子集，驻留在人类的斑块和加重了动脉粥样硬化。这项建议是支持这种观察的，PMap激活单核细胞上调巨噬细胞标记（CD14,CD36CD68）表达，并大量释放MMP和H2O2,这些因素构成了斑块的不稳定和最终的破裂，一个在动脉粥样硬化性疾病的临床突发事件。早先的研究已经表明，PMap的产生是在保存的血小板中的一个持续的过程，并且在血小板活化明显缺乏的情况下。在流通的领域，像其他的凋亡小题，这些微粒将积极脱离约束力和吞噬。可以想象，这种去除白细胞，尤其是PMap介导的单核细胞的相互作用。事实上，血小板碎片和单核细胞的共集合，健康受试者血液中可检测到。另一方面，这种相互作用可能有助于白细胞的长期分化，正如我们在本文中指出的那样，甚至可以在驻地发展偏光因素的单核细胞。然而，进一步的工作需要证明促PMap的单核细胞与M2细胞和体内驻地巨噬细胞/树突状细胞的不同。目前的结果表明，PMap具有调节免疫的潜能，由于刺激他们自己的食菌细胞的移除，如CD11b，CD1434和CD3625，所有的这些已经被牵连在凋亡物质的吸收上面了。这个建议被证实是由于促炎性和非炎性细胞因子的作用结果，包括G-CSF,GM-CSF和肿瘤坏死因子，这些是由PMap接触单核细胞造成的。总之，这是首次研究证明，微粒自发地从细胞凋亡的血小板产生的，能促进对驻地吞噬型的单核细胞，改变他们的行为和激活状态，因此，提出一种新的机制，血小板和他们的产品可能影响动脉粥样硬化性疾病的进展。材料和方法单核细胞和初级单核细胞人类急性单核细胞白血病THP-1细胞用RPMI-1640培养基培养，同时添加L谷氨酸和10%的胎牛血清（FBS）。MCs是从周边血液的血沉棕黄层中获得的，这些事从健康的知情器官捐献者中提取的。单核细胞与中性粒白细胞中分离，采用密度梯度离心，进一步选择使用磁珠单核细胞分离试剂盒2,根据制造商的协议。单核细胞制备的纯度是由基于对细胞的流式细胞仪分析获得的，纯度达497%。血小板衍生微粒和洗涤血小板PMap是从血小板血浆中分离的，被储存在标准血库中5天。血小板被拆除，快速离心5分钟4000Xg。血小板血浆制剂离心60分钟20000Xg。含有PMap的微粒悬浮在PH7.45的HEPES缓冲液中，通过0.8毫米的过滤器过滤，以去除残留的血小板，再次20000Xg40分钟离心。上清液用于控制实验。用HEPES缓冲液再悬浮颗粒后，PMAP标记的抗CD61-FITC单克隆抗体，通过流式细胞仪计数。大小被估计，除了1和6毫米的荧光珠。CD61阳性06毫米计算为PMap。PMap悬浮液直接使用或者冷冻在液氮中。分离的PMap实际上对于外切标记CD63来说是阴性的。正如所描述的那样，血小板从新鲜的人体血液中分离出来。流式细胞仪测定细胞表面标记使用六十细胞仪上荧光激活细胞分选第二血小板和PMap表面荧光标记蛋白水平CD61和CD62p抗体或者激活GPllb/llla受体。磷脂酰丝氨酸的表达，探讨APC-膜联蛋白A5、THP-1细胞或悬浮液中的细胞CD11b、CD31、CD14、CD16、CCR2、CCR5、CXCR4或者CD36。并如前所述准备。使用流式细胞仪荧光激活细胞分选出第二血小板和PMap表面荧光标记蛋白水平，示踪细胞内的CD68，并用多聚甲醛固定细胞，用0.5%TRITON-X-100鼠抗CD68mAb染色。相对应的阴性对照抗体是IgG1;IgG2b，k或者IgG2a和建议稀释使用。表达水平被呈现荧光直方图的等比中项，修正了与同型对照抗体相比较的值。单核细胞的粘附在含有5%FBS的RPMI-1640培养基中THP-1细胞的粘附被测量，如下所述。在37°C下，用工具，PMA，血小板或者PMap处理的细胞，被粘附在纤粘连蛋白表面。在指定的时间里，有活力的细胞被用BCECFacetoxymethylester处理一小时，然后测量所有细胞和粘连细胞的荧光性，使用SpectraFluoPlus读取。念连代表了所有细胞荧光的百分比。孵化被一式三份。平行实验，示踪细胞被刮掉，并通过校准流式细胞仪计数，本质上是相同的结果。原发性单核细胞粘附于人体主动脉内皮细胞单核，在流动条件下测定微观视频影像。在37C下细胞被孵育在HEPES缓冲液,PMap或者血小板中44h。期间灌注粘附单核细胞至少要算5个随机微观领域。碳酸脂膜细胞迁移实验在5mm小孔的碳酸脂膜板上，底部会被媒介物，CCL2或者PMap充满，或者与同型向控制或CCL5和CXCL7抑制性抗体在RPMI-1640培养基中。在含有5%的FBS的RPMI-1640培养基中上气室包含THP-1细胞。在经过37C24h培育之后，在底部和上部的细胞被流式细胞仪计数。检测运行三次。Transmigrated细胞的百分比被计算出来。在不同的孵化条件下，细胞总数保持不变。单核细胞功能分析在37C