浅论不同pH值条件下Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性效应

浅论不同pH值条件下Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性效应【摘要】目的：研究不同pH值条件下，重金属Cr6+对淡水绿藻小球藻和斜生栅藻生长的毒性效应，为我国水质量基准和标准的科学制定提供参考资料。方法：依据OECD201藻类生长抑制实验指南，以72h藻生物量为测试终点进行藻类抑制实验。结果：两种藻在不同初始pH值条件下的生长潜势不同，小球藻的最适pH值为，而斜生栅藻的最适pH值为。在不同初始pH值条件下，Cr6+对小球藻和斜生栅藻的作用均为低浓度(mg·L-1)刺激而高浓度(mg·L-1)抑制，且浓度越大抑制率越高。对于小球藻Cr6+在pH值=时毒性最小，在pH值=时毒性最大;对于斜生栅藻Cr6+在pH值=时毒性最小，在pH值=时毒性最大。结论：Cr6+在藻的最适pH值条件下毒性最小。

【关键词】Cr6+;小球藻;斜生栅藻;pH值;水质量基准

[Abstract]Objective：Thetoxicologicaleffectsofhexavalentchromium(Cr6+)onthegrowthoffreshwatergreenalgae,Chlorellavulgaris(C.vulgaris)andScenedesmusobliquus(S.obliquus)wereinvestigatedatdifferentpHlevelsinordertoprovidereferencestothescientificestablishmentofwaterqualitycriteriaandstandardinChina.Methods:AccordingtotheOECDguidelinesforthetestingofchemicals,freshwateralgaandcyanobacteriagrowthinhibitiontest(OECD201),taking72hbiomassastheendpoint,thealgalinhibitiontestswereconducted.Results:ThealgagrewdifferentlyatdifferentinitialpHlevels,andtheoptimalgrowthpHofC.vulgariswaspH=,whiletheoptimalpH=forS.obliquus.AtdifferentinitialpHlevels,Cr6+hadthestimulatingeffectsonbothC.vulgarisandS.obliquuswhentheconcentrationswerelowerthanmg·L-1,andtheinhibitioneffectswereobservedwhentheconcentrationsofCr6+werehigherthanmg·L-1.TheinhibitioneffectsgrewstrongerwiththeincreasingoftheCr6+concentrations.ForC.vulgaris,thetoxicityofCr6+wasminimumatpH=,andmaximumatpH=ForS.obliquus,thetoxicityofCr6+wasminimumatpH=,andmaximumatpH=Conclusion:ThetoxicityofCr6+isminimumattheoptimalpHofthealgae.

[Keywords]hexavalentchromium;Chlorellavulgaris;Scenedesmusobliquus;pHlevels;waterqualitycriteria

我国水生态基准的制定研究零星、分散，当前我国《地表水环境质量标准》[1]的标准值主要是参考美国各州、日本、前苏联、欧洲等国家及地区的水质基准值和标准值来确定，没有考虑我国水生态系统的区域性特征。水生态体系的区域性特征如水文条件、气候等多种因素都会影响污染物在水环境中的物理、化学和生物过程，因而可能导致不同的生态效应，这就要考虑到水生态系统的差异性对水生态基准的影响。因此，在制定水生态基准时，开展环境因子对污染物毒性影响的研究十分必要。

铬(Cr)被广泛用于皮革制造业、纺织业、电气行业等，是水体中主要的重金属污染物之一。Cr的毒性与其存在的状态有极大的关系，自然水体中Cr主要以Cr3+和Cr6+的形式存在，Cr6+的毒性较强，约为Cr3+的100倍，且具有强致癌、致畸、致突变作用[3-4]。有调查显示，在我国的十大流域都不同程度地存在着Cr6+的污染。在水生系统及水生食物链中，藻类作为水生动物的食物及氧气来源占有重要位置。重金属通过各种途径进入水体后，首当其冲的受害者就是藻类生物，且藻类相对细菌或水生动物而言，对毒物更敏感[6-7]。目前已有很多关于重金属对藻类影响的研究，小球藻(Chlorellavulgaris)和斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)是典型的绿藻代表藻种，广泛存在于我国的水体中，对二者的研究已有很多报道[8-10]。

OECD(OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment，经济合作与发展组织)提出的淡水藻生长抑制实验规范(OECD201)[11]被广泛应用到污染物对藻类的毒性实验研究当中，它已成为被国际公认的进行重金属对藻类毒性风险评价的实验规范之一[12]。本实验按照OECD提出的淡水藻生长抑制实验规范，选取72h藻生物量为指标，研究不同pH值条件下重金属Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性效应，旨在为研究重金属对水生生物及水生态系统的毒害作用以及我国水体质量基准和标准的制定提供科学依据。

1材料与方法

材料

供试小球藻和斜生栅藻藻种均购自中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库。采用BG11培养基培养[13]。由于EDTA会与重金属形成螯合物，影响重金属的毒性[14]，所以去掉培养液中EDTA成分[15]，培养液初始pH值为。将适量处于对数生长期的藻接入装有100ml培养液的250ml三角瓶，在温度(25±2)℃、光照4000～6000Lux、光暗比为12h∶12h的光照培养箱内培养。每天人工摇瓶3～4次，随机更换瓶的位置，使其受光均匀。

供试重铬酸钾(K2Cr2O7)购自天津市北方天医化学试剂厂，分析纯。

实验方法

采用国际通用的“瓶法”，按照OECD201淡水藻生长抑制实验指南[11]，以72h藻生物量为测试终点进行藻类毒性实验。测定藻的光密度值(OD680)，建立藻细胞密度(y)与光密度值(x)间的线性关系(pH值=)。回归方程：斜生栅藻，y=2+，R2=;小球藻，y=2，R2=。计算比生长率和抑制率。

μ=(lnXj-lnXi)/(tj-ti)(day-1)

其中，μ表示比生长率，day-1;Xj表示第j天的初始藻细胞数，ml-1，Xi表示第i天的藻细胞数，ml-1;ti表示某时段初始时间，day;tj表示某时段结束时间，day。

I=(μc-μt))/μc×100(%)

其中，I为抑制率;μc为对照组的比生长率，μt为处理组的比生长率[11]。

OECD曾推荐用无观察效应浓度(noobservedeffectconcentrations,NOEC)和EC05或EC10置信区间的下限来作为安全暴露基准浓度，同时给出最小观察效应值(lowestobservedeffectconcentrations,LOEC)。NOEC指的是毒性作用与对照组无显着差异的最大处理浓度;LOEC指与对照组有显着差异的最小浓度;EC05和EC10分别指产生5%和10%毒性效应的浓度[16-17]。本研究采用SPSS进行数据处理，用单因素方差分析比较显着性差异，采用Dunnettt检验进行多重比较以确定Cr6+对小球藻和斜生栅藻的NOEC和LOEC，并对结果进行回归分析，得出EC05和EC[18-19]10。

实验内容

pH值对藻生长的影响自然水体的pH值范围一般是中性偏碱，本实验设定初始pH值为±、±和±(以下简写为pH值=、和)，用HCl和NaOH调节培养液的pH值。接种一定量处于对数生长期的藻，每个pH值设3个平行，置于人工气候箱中，每隔24h测定藻的光密度值。

pH值对Cr6+毒性的影响在初始pH值为、和的培养液中加入不同体积的Cr6+贮备液，充分摇匀后接入一定量处于对数生长期的藻。设置Cr6+的10个处理浓度和1个空白，处理组Cr6+的浓度分别为1、、、、、、、、和mg·L-1(离子浓度)，每个处理组设3个平行。放入培养箱中，测定72h时藻光密度值(OD680)，并计算Cr6+对藻生长的抑制率以及毒性效应值EC05和EC10。

2结果与讨论

pH值对藻生长的影响

由图1可见，在初始pH值=时，小球藻在48h和72h时的生长显着高于pH值=和时();斜生栅藻在pH值=时在48h和72h时的生长显着高于pH值=时()，但与pH值=相比没有达到显着性差异。有资料表明，小球藻的最适pH值为～[20]，而斜生栅藻的最适pH值为～[21]，这与本实验结果一致。

*，**。以pH值=为基础作统计分析

图1pH值对小球藻和斜生栅藻生长的影响

Fig1TheeffectsofpHonthegrowthofChlorellavulgarisandScenedesmusobliquus藻类生长与藻本身的生理特点以及温度、光照、营养盐、其它生物、pH值等诸多环境因素有关，其中水体pH值是一个重要的生态因子，与藻类生长关系密切。不同藻类有一定的pH值适应范围，即使同一属的两种藻，在不同pH值下，其生长也可能有很大差别[22]。水体pH值主要从两方面对藻生长产生影响，一方面改变环境酸碱度，酸性太强(H+浓度高)或碱性太强(OH-浓度高)都会对藻细胞产生伤害，只有在适宜的酸碱度范围内藻细胞才能正常生长繁殖;另一方面是影响碳酸盐平衡系统以及不同形态无机碳分配关系，从而对藻类生长产生影响[21]。在低pH值下大部分的无机碳以CO2的形式存在，而在高pH值下(pH值7)，大部分的无机碳是以HCO-3的形式存在[23]。Shiraiwa等[24]研究指出，空气中生长的小球藻利用CO2，而几乎不利用HCO-3;斜生栅藻除了可以利用CO2，还可以利用HCO-3进行光合作用[23]，这可能是斜生栅藻在pH值=而小球藻在pH值=生长较好的原因之一。

不同pH值下Cr6+对藻的毒性效应

水体中Cr3+和Cr6+可以发生相互转化。有研究表明随着pH值的增大，Cr6+的还原作用逐渐降低，当pH值≥6时，Cr6+的光还原反应基本消失[25]。72h培养实验结束时测定试液中的pH值，各组都有上升的趋势，即均在偏碱性的范围内。其主要原因可能是藻类生长致使pH值升高[22]。同时，依据《水和废水监测分析方法》[26]，采用二苯碳酰二肼法测定反应开始和结束时水体中Cr6+的含量，结果显示Cr6+基本没有被还原。因此，本实验的结果可以被认为都是Cr6+的毒性效应。

在72h时测定藻的光密度值，计算各个浓度Cr6+对藻生长的抑制率[11]，以剂量效应关系作图(图2)，并对结果进行分析，得出不同pH值条件下的NOEC、LOEC、EC05和EC10，结果见表1、2。

图2中比较了不同初始pH值条件下，Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性效应。当pH值不同时，相同浓度的Cr6+对藻产生毒性作用不同，且有种类差异，表明pH值对Cr6+的毒性效应产生影响。Cr6+对不同藻产生的毒性强度不同，但都表现为低浓度(mg·L-1)下有刺激作用，促进藻的生长;在高浓度(mg·L-1)时产生抑制作用，抑制藻的生长，且浓度越大抑制效应越强。这种低浓度促进、高浓度抑制作用在许多研究中都被发现[27]，称为Hormesis效应[28]。

由表1和表2结果得出，Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性效应值分别在pH值=和pH值=时最大，说明Cr6+对其的毒性分别最小。可见，在两种藻的最适pH值条件下Cr6+的毒性最小。Cr6+对小球藻毒性大小顺序是pH值=值=值=，Cr6+对斜生栅藻的毒性大小顺序为pH值=值=值=，随着pH值的增大，Cr6+对斜生栅藻的毒性逐渐减小。

重金属对藻类的毒性作用取决于金属元素的形态、浓度、环境因素和重金属元素之间的相互作用，也取决于实验藻种及藻类细胞的生理生化过程。其中影响重金属毒性的环境因素主要有pH值、温度、光照、溶氧及螯合剂等[29]。本实验结果表明，pH值对Cr6+的毒性效应产生影响，表现为在藻的最适生长pH值条件下Cr6+的毒性最小，说明藻生长较好时对毒物的抗性就大。

比较表1和表2的结果，同样在最适生长pH值条件下，Cr6+在pH值=时对斜生栅藻的EC05和EC10值(和mg·L-1)明显低于小球藻在pH*，**。以空白为基础作统计分析表2不同pH值下斜生栅藻的NOEC、LOEC、EC05和EC10

值=时的EC05和EC10(和mg·L-1);斜生栅藻在pH值=时的EC05和EC10也要小于小球藻在pH值=时的EC05和EC10，表明Cr6+对斜生栅藻的毒性要大于对小球藻的，即斜生栅藻要比小球藻对Cr6+更加敏感。许多研究结果[30]表明，斜生栅藻要比小球藻对污染物更敏感，这和本实验的结果一致。

一般在确定污染物的环境基准时，只考虑对所选择典型代表生物的毒效应，很少一并考虑环境因素。但从生态学角度，环境因素的影响不可忽视。我国幅员辽阔，不同流域/区域水环境生态特征、水环境承载力等都有很大的差异。由于水生态体系的局域性特征如水文条件、气候、群落的生态结构等多种因素都会影响污染物在水环境中的物理、化学和生物过程，因而可能导致不同的生态效应。因此，在制定我国的水质标准时，要充分考虑到环境因子对污染物毒性的影响。

3结论

(1)不同藻种所适应的生长环境条件不同，本实验条件下，小球藻的最适pH值为，而斜生栅藻的最适pH值是。

(2)Cr6+对小球藻和斜生栅藻在不同pH值条件下的毒性大小顺序分别为：pH值=值=值=，pH值=值=值=，在藻最适生长pH值时Cr6+的毒性最小;随着pH值增大，Cr6+对斜生栅藻的毒性逐渐减小。Cr6+对斜生栅藻的毒性比小球藻的大，即斜生栅藻比小球藻对Cr6+更敏感。

(3)在不同pH值条件下Cr6+对藻的毒性效应不同，表现为在藻最适pH值时，其毒性效应最弱。因此，在制定水质基准和标准时，考虑环境因子条件对污染物毒性的影响是非常必要的。

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