兽医生物制品基本生产技术-病毒培养技术（兽医生物制品技术）

病毒的动物接种增殖技术动物接种法可用于病毒病原性的鉴定、疫苗效力试验、疫苗生产、抗血清制造及病毒性传染病的诊断等。此法技术简单，容易获得成功，但是对动物的要求高，结果判定困难，此外需要有隔离畜舍、良好的饲养管理和消毒设备，耗费较大。病毒的动物接种增殖技术1.动物的选择对相应病毒易感，并十分敏感。青壮年，健康，体内没有相应抗体家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应为非免疫或SPF级标准；犬和猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准。体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。病毒的动物接种增殖技术2.病毒接种途径（1）皮下接种选择皮肤松弛、肌肉和脂肪少的部位。（2）皮内接种一般用于较大动物，可选背部、颈部、腹部、耳及尾根部，亦可选足掌部。（3）肌肉接种一般选用肌肉发达、无大血管经过的部位。病毒的动物接种增殖技术（4）静脉接种小鼠和大鼠常采用尾静脉，豚鼠一般采用前肢皮下头静脉，兔一般采用耳外侧边缘静脉。（5）腹腔接种（6）脑内接种病毒的动物接种增殖技术3.动物的饲养管理动物接种后继续饲养，提供良好的饲养条件。接种不同病毒的动物须分室饲养。对照组也应分室隔离，并提供与实验组相同的饲养管理条件。每天观察动物活动情况、食欲、粪尿及被毛状态，接种局部反应，体温，呼吸、脉搏及特征性临床变化等。病毒的动物接种增殖技术4.病毒的收获选择症状和病变符合要求的动物。采集含毒量高的体液、组织脏器，经检查合格后即可使用。病毒的禽胚接种增殖技术几乎所有的禽源病毒都能在禽胚中增殖，某些哺乳动物的病毒也能适应禽胚。禽胚中应用最多的是鸡胚，有时也用鸭胚、鹅胚。本法优点是禽胚来源充足、价格低廉、可以实现规模化和机械化操作。病毒的禽胚接种增殖技术1.禽胚的选择理想的禽胚是SPF鸡胚，非免疫鸡胚也可代替。不同病毒对禽胚的适应性不同，实际应用时应加以严格选择。禽胚应发育良好，照胚时可见清晰的血管及胚体的活动。病毒的禽胚接种增殖技术2.禽胚接种途径（1）尿囊腔接种选用9～11日龄鸡胚。病毒的禽胚接种增殖技术（2）绒毛尿囊膜接种选用10～13日龄鸡胚。多用于嗜皮肤性病毒的增殖。病毒的禽胚接种增殖技术（3）卵黄囊接种选用5～8日龄鸡胚。除了培养某些病毒外，该途径还可用于培养立克次氏体、衣原体和支原体。病毒的禽胚接种增殖技术（4）羊膜腔接种选用10～12日龄鸡胚操作时须在照蛋灯下进行。病毒的禽胚接种增殖技术3.接种后检查和病毒收获接种病毒后，鸡胚于37℃继续孵化2～7d，每天至少照蛋1～2次。弃去接种24h内死亡的鸡胚，24h后死胚和感染胚及时取出，4～8℃放置4～24h或-20℃放置0.5～1h后收获病毒。不同的接种途径，收获的内容物不同。收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存备用。病毒的禽胚接种增殖技术4.注意事项严格无菌操作。操作时应防止鸡胚损伤。病毒培养时应保持恒定的适宜条件。注意用具、环境的消毒和鸡胚的无害化处理。高致病性禽流感病毒必须在P3实验室和生物安全柜内进行接种和收获。病毒的细胞接种增殖技术1.细胞的标准易感、无外源性微生物污染·宿主动物细胞

如，猪甲状腺细胞培养猪传染性胃肠炎病毒·非宿主动物细胞

如，鸭胚成纤维细胞培养马立克氏病病毒。病毒的细胞接种增殖技术2.影响病毒在细胞中增殖的因素

（1）血清维持液中血清含量：一般不超过2%

（2）温度最适温度多为37℃。有些病毒生长的最适温度高于或低于37℃。如，狂犬病病毒为32℃（3）pH维持液PH值一般为7.6-7.8病毒的细胞接种增殖技术

（4）接毒量维持液体积的1%-10%，科学的接种量应以TCID50为依据。（5）接毒方法异步接毒细胞长成单层后倒去生长液，接种病毒，37℃吸附一定时间后加入维持液，多数病毒采用此种方式。同步接毒在种植细胞的同时或种植4小时内接种病毒，主要用于在细胞有丝分裂盛期进行复制的病毒，如，细小病毒。病毒的细胞接种增殖技术3.病毒增殖的判断指标细胞病变效应（CPE）细胞圆缩细胞聚集形成合胞体轻微病变倒置显微镜

接种单纯疱疹病毒1型的人角膜上皮细胞（CPE）（A-正常细胞，B-感染后8h，C-感染后12h，D-感染24h）病毒的细胞接种增殖技术病毒的细胞接种增殖技术4.病毒的收获一般在CPE达80%左右时收获。通过冻融、超声波等方式破碎细胞，使病毒充分释放，再去除细胞碎片。病毒液于-20℃以下保存。细胞结合型病毒，收获感染细胞直接于液氮中保存。病毒的增殖过程病毒只能在活的易感细胞内以复制的方式进行增殖。病毒的一个复制周期，包括以下几个步骤：

吸附→侵入→脱壳→生物合成→装配与释放病毒的增殖过程1.吸附毒粒易感细胞静电吸引病毒表面蛋白与细胞受体结合病毒的增殖过程2.侵入胞饮作用直接侵入有囊膜病毒无囊膜病毒侵入方式囊膜与细胞膜融合病毒的增殖过程3.脱壳病毒侵入细胞后，囊膜和/或衣壳除去而释放出核酸的过程。毒粒消失，失去原有的感染性，进入隐蔽期。脱壳是病毒基因组进行功能表达所必需的。自毒粒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性毒粒的时间。病毒的增殖过程4.生物合成病毒利用宿主细胞作为生物合成机构，使病毒核酸表达和复制,产生大量的病毒蛋白质和核酸。mRNA的合成早期：特异性酶的合成核酸复制结构蛋白质合成病毒的增殖过程5.装配与释放新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒的装配,亦称成熟。成熟的子代病毒颗粒以一定的途径释放到细胞外。有囊膜病毒在出芽释放过程中获得囊膜。细胞的冻存与复苏二倍体细胞株与传代细胞系需液氮（-196℃）保存。为保持细胞的最大活率，一般采用慢冻快融法。细胞在液氮中可贮存3～5年,但为妥善起见,每冻存1年应再复苏1次。细胞的冻存与复苏1.细胞的冻存消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。1000r/min离心10min，弃上清液。沉淀加含保护剂（二甲基亚枫）的培养液，计数，将细胞调整至5×106个/ml左右。将悬液分至冻存管中，每管1ml。将冻存管口封严。如用安瓿则需火焰封口。贴上标签，写明细胞种类、冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳，以便取出时方便。细胞的冻存与复苏1.细胞的冻存温度梯度降温：室温，4℃（20min），冰箱冷冻室（30min），低温冰箱（-80℃，1h），气态氮（30min），液氮。操作时应小心，以免液氮冻伤。定期检查液氮，随时补充，绝对不能挥发尽。细胞的冻存与复苏2.细胞的复苏冻存管从液氮中取出后，迅速置于37～40℃水浴1min。将细胞悬液于1000r/min离心10min，弃上清。沉淀加10ml培养液悬浮后，再离心10min，弃上清。将细胞转移至培养瓶，37℃培养，第2天观察生长情况。细胞的类型1.根据生长是否附于支持物（1）贴附型细胞细胞贴附在支持物表面生长。根据细胞形态大致分为

①成纤维型细胞②上皮型细胞③游走型细胞④多形型细胞细胞的类型

①成纤维型细胞

鸡胚成纤维细胞细胞的类型

②上皮型细胞

细胞的类型

③游走型细胞

细胞的类型

④多形型细胞

神经细胞细胞的类型1.根据生长是否附于支持物（2）悬浮型细胞细胞不贴于支持物，悬浮在培养液中生长，胞体呈圆形。细胞的类型1.根据染色体和分裂特性（1）原代细胞由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞。胚胎和幼畜的组织细胞更容易生长。天然宿主的细胞适合分离病毒。制备活疫苗时，多主张不用同源细胞，以免混入潜在病原，须使用SPF动物的组织制备细胞。原代细胞一般仅可传3代左右。细胞的类型1.根据染色体和分裂特性（2）二倍体细胞株指原代细胞经定向培育后形成的具有特殊生物学性状的细胞，保持了原来的二倍染色体数目。广泛适用于病毒性生物制品制备，安全可靠。能连续传50～100代。细胞的类型1.根据染色体和分裂特性（3）传代细胞能在体外无限传代，其染色体数目及增殖特性类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞。多用于病毒的分离鉴定。细胞的制备1.原代细胞的制备操作方法：选取适当组织或器官，采用机械分散法如剪碎、挤压等使之成为小块(约为1mm3)，然后用0.25％～0.5％胰酶(pH7.4～7.6)消化掉细胞间的组织蛋白，吸去胰酶消化液，加入生长液，吹打成分散的细胞，用于培养。胰酶消化的时间与温度、组织的来源及大小等有关，一般37℃消化10～30min，4℃消化需要过夜。细胞的制备原代细胞的制备细胞的制备2.单层细胞的传代多采用EDTA(乙二胺四乙酸)-胰酶消化法，胰酶浓度为0.025％，EDTA浓度为0.01％。具体方法：单层细胞弃去营养液，加37℃预热的EDTA-胰酶消化液（覆盖细胞表面），待细胞开始脱落时，弃去消化液，加入少量生长液轻轻吹打使细胞分散，再用生长液稀释，分装成2～3瓶培养。某些半悬浮培养或悬浮培养的细胞如SP2/O瘤细胞，不需消化液消化，采用机械吹打即可形成单细胞。细胞的制备单层细胞的传代细胞培养方法静置培养转瓶培养悬浮培养（狭义）微载体培养微囊化培养中空纤维培养悬浮式培养细胞培养方法1.静置培养将细胞悬液分装入培养瓶、培养板、或培养皿置CO2恒温箱内静署培养，细胞沉降贴壁后生长形成细胞单层。装量为培养器皿容积的1/10，原代细胞含量为40-50万/ml。细胞培养方法2.转瓶培养将细胞悬液接入转瓶后放于恒温箱的转鼓上，转鼓带动转瓶不断缓慢旋转，细胞贴附在瓶壁四周，长成单层。转鼓转速一般为10-20r/h，原代细胞接种量一般为120-200万/ml。台式转瓶机细胞培养方法生产型转瓶机细胞培养方法3.悬浮培养通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内的培养方法，不适用于贴附型细胞。一般采用磁力搅拌或转鼓旋转(2400r／min)，使细胞保持悬浮。悬浮培养细胞瓶细胞培养方法悬浮培养生物反应器细胞培养方法4.微载体培养以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌使其悬浮在培养液内，细胞贴附于载体上生长形成单层。培养时，可将微载体和细胞种子悬液等一起加入反应器中，先静止数小时(37℃)进行细胞贴附，然后补足生长液开始搅拌（速度为40-70r/min）培养。细胞培养方法生物反应器微载体培养HEK-293细胞形态（100×）细胞培养方法5.微囊化培养将细胞包裹于微囊中，然后置于培养液中进行悬浮培养。此法很适合生产单克隆抗体。微囊化的神经细胞细胞培养方法6.中空纤维培养该技术模拟动物体内环境，使细胞在中空纤维上形成类似组织的多层细胞生长。此法特别适合分泌型细胞。细胞培养方法中空纤维生物反应器细胞培养要素1.培养液现多用合成培养液。不同培养液适用于不同细胞。

如，Eagle氏液适用于各种二倍体细胞199多用于原代肾细胞RPMI-1640和DMEM主要用于肿瘤细胞和淋巴细胞。细胞培养要素2.血清血清中含有细胞生长的部分必需氨基酸，还有促进细胞贴壁的成分。目前多用犊牛血清，用前经56℃灭活30min。细胞培养液生长液--用于细胞分裂生长，使细胞贴壁生成单层。血清含量为5％～20％，多为10％。维持液--用于维持单层细胞的存活和某些生命活动。血清含量为0％～5％，尽可能不加。细胞培养要素3.细胞接种量适宜的培养条件下，接种细胞需要达到一定量才能生长繁殖。细胞接种量和形成单层的速度有关，接种细胞数量越大，生长为单层的速度越快，但接种量过多会使细胞的生长受到抑制，甚至死亡。一般鸡胚成纤维细胞为100万／mL，小鼠或地鼠肾细胞为50万／mL，猴肾细胞为30万／mL，传代细胞为10～30万／mL。细胞培养要素4.PH细胞生长的pH为6.6～7.8，最适pH为7.0～7.4。细胞代谢产生的各种酸性物质可使pH下降，所以培养液中需加入缓冲体系如碳酸氢盐、磷酸氢盐等进行缓冲。必要时可加入氢离子缓冲剂HEPES(10～15mol／L)，以增加培养液的缓冲能力。细胞培养要素5.温度细胞培养的最适温度应与细胞来源的动物体温一致。在最适温