牙髓培养细胞体外诱导矿化能力：冠髓与根髓的比较

牙髓培养细胞体外诱导矿化能力：冠髓与根髓的比较【摘要】目的比较人牙髓的根、冠髓培养细胞体外诱导矿化能力，探讨牙髓干细胞在牙髓中的定位。方法用组织块法对人牙的根髓和冠髓细胞进行原代和传代培养，将第五代培养细胞用条件培养液诱导矿化，在诱导后第10、20、30天对细胞进行VonKossa钙染色。结果根髓中形成的矿化小结比冠髓中更早、更强烈。结论根髓比冠髓更容易诱导矿化。牙髓干细胞可能存在于根髓和冠髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度。

【关键词】牙髓干细胞；细胞培养；矿化结节

Theinducedmineralizationabilityincultureddentalpulpcells:thecomparationbetweencoronalandrootpulpcells

【Abstract】ObjectiveTocomparethemineralizationabilitybetweencultureddentalrootandcoronalpulpcells,andtoinvestigatethelocalizationofdentalpulpstemcells(DPSCs)indentalpulps.MethodsThehumandentalrootandcoronalpulpcellswereculturedintissue-explantmethod,the5thgenerationofcellsweresubculturedwithconditioningmedium(20%DMEM+10nmol/L+dexamethasone+50mg/Lascorbicacid)toinducemineralization.Atthedaysof10,20,30afterinducing,vonKossaforcalciumstainingwasusedtoinvestigatethemineralizationabilityinrootandcoronalpulpcells.ResultsThemineralizationnodulesappearedearlierandstrongerintherootpulpcellsthanthatinthecoronalpulpcellsobservedinphase-contrastmicroscopeandvonKossastaining.ConclusionRootdentalpulpcellscouldbeinducedtomineralizationmoreeasilythanthecoronalpulpcells.DPSCsmayexistinbothrootandcoronalpulp,anditsdensityintherootpulpishigherthanthatincoronalpulp.

【Keywords】dentalpulpstemcells；cellculture；mineralizationnodules

牙髓干细胞在成体牙髓腔中的定位问题是牙体组织工程学中尚未解决的基本问题。研究表明，体外培养的DPSCs和骨髓干细胞一样，都具有在一定条件下诱导矿化形成矿化小结的能力，矿化小结的形成是DPSCs分化的标记。本文通过对体外培养的人牙髓髓细胞诱导矿化，并对其矿化能力进行比较，以探讨DPSCs在牙髓中的定位。

1材料与方法

主要实验器材及试剂CO2培养箱；超净工作台；相差显微镜；细胞培养瓶及培养板；高速离心机；细胞记数板；高糖DMEM培养基；胎牛血清；地塞米松；L-抗坏血酸；β-甘油磷酸钠。

实验方法

细胞培养收集5颗16～25岁健康人因正畸或阻生而拔出的第三磨牙，在无菌条件下分别取其根髓和冠髓，用组织块法进行细胞原代和传代培养［1］，培养液为DMEM。

细胞染色分别将生长状态良好的冠髓和根髓细胞接种于有盖玻片的6孔板上，当细胞汇合约60%～70%时，改用条件培养液，连续培养30天。在倒置相差显微镜下观察矿化结节形成情况。分别于10、20、30天时，取出盖玻片，按VonKossa法进行染色。染色方法取出长有细胞的盖片，PBS冲洗3遍，FAA固定液中固定30min。蒸馏水冲洗3次。固定后的细胞加入5%的硝酸银溶液，良好日光下染色1h，蒸馏水冲洗，5%的硫代硫酸钠作用1～2min，再用蒸馏水洗5min，干后封片，或伊红复染，常规脱水后封片。

结果判断：矿化结节被染成深黑色。

对照设计体外培养的牙周韧带细胞具有较强的钙化能力，用作VonKossa钙染色的阳性对照片。

2结果

相差显微镜下观察在矿化培养2天时，根髓细胞出现融合现象，细胞间隔消失，冠髓细胞无明显变化；矿化培养10天时，根髓细胞呈局灶性复层生长，呈网状或束状排列；15天时，根髓复层中央部分细胞进一步密集，形成细胞结节，冠髓细胞开始出现复层生长；矿化培养20天时，根髓细胞结节中央出现黑色高密度物质沉积，并且随着时间延长增多，冠髓细胞结节中央开始出现少量褐色沉积物；矿化30天时，根髓出现明显的黑色矿化结节，冠髓中有小而少的矿化结节出现。

VonKossa法钙盐染色

根髓细胞于诱导培养20天时，在细胞结节中央出现被染成黑褐色的小块，表明钙质沉积。诱导培养30天时，黑色小块进一步增大(见图1略)。

冠髓细胞20天时，尚无染色阳性矿化结节形成。30天时，少数区域出现矿化结节，体积较小且强度微弱(见图2略)。

阳性对照片相同染色条件下体外培养的牙周韧带细胞出现黑色团块。

3讨论

本实验发现体外持续培养的牙髓细胞在诱导剂作用下经历了融合期、复层生长期、细胞结节形成期而最后发生矿化，这与Tsukamoto等［2］的观察相一致。研究发现，体外培养的牙髓细胞能复层生长，在一定条件下能分泌形成类牙本质样的矿化结节［3］。结节中细胞是处在分化中的成牙本质细胞前期,体外培养单层生长的细胞不具有形成矿化基质的能力而牙髓细胞复层生长可以形成细胞结节，细胞结节所具有的三维结构是形成钙化的先决条件［4］。

牙髓干细胞经过诱导可以形成矿化结节，矿化结节的形成代表了牙髓干细胞的存在。由于矿化的形成是牙髓细胞向成牙本质细胞分化的标志，本实验在相同诱导条件下根髓比冠髓矿化发生得早，说明根髓中牙髓干细胞的密度高于冠髓，或者根髓细胞向成牙本质细胞分化的潜能比冠髓细胞大。

对DPSC存在的部位存在着不同的认识。牙齿的发生是由上皮与间充质相互作用下完成的，根尖区是牙根的生发中心。从牙齿发育学角度考虑，牙髓干细胞主要存在于根尖区。Harada采用器官培养方法对切牙根尖末端培养，发现由新分化形成的成釉细胞和成牙本质细胞产生了釉质和牙本质,表明干细胞起源于根尖区的颈环上皮［5］。

牙髓是牙齿发育完成之后存留于牙髓腔中的疏松结缔组织，牙髓中的成牙本质细胞可不断分泌牙本质基质，并矿化形成牙本质。若受到刺激，将导致受刺激部位的成牙本质细胞变性坏死，将由新分化形成的成牙本质细胞取代，并形成修复性牙本质。刺激常发生于冠部，所以修复性牙本质常出现在冠部。该现象说明牙冠部就存在着能分化为成牙本质细胞的牙髓干细胞,还可能是牙齿受到刺激后，通过Nortch信号传递，牙髓干细胞由根部的干细胞迁移分化而来［6］。本实验通过对培养细胞的相差显微镜观察和茜素红染色，发现根、冠髓细胞在一定诱导条件下皆具有形成矿化结节的能力，说明根髓和冠髓中都存在牙髓干细胞。

对于冠部、根部牙髓组织学特征，Murray等［7］做了研究比较，发现冠部细胞密度要高于根部，但根部牙本质沉积率却比冠部高。这种现象说明根部牙本质的高沉积率不是成牙本质细胞的数量导致的,而与根部成牙本质细胞的功能活跃有关。提示冠部、根部牙本质分泌的机制存在差异。研究发现随年龄的增长，根髓较快的发生退行性变如细胞数量的减少、纤维增多、髓石形成等。因而可以认为，冠、根部的种种差异与干细胞在冠髓根髓中的密度密切相关。

我们的前期研究发现［1,8,9］，根髓细胞比冠髓细胞更容易培养，根髓细胞的碱性磷酸酶活性高于冠髓，牙髓细胞经体外诱导矿化并经茜素红染色后，根髓比冠髓中具有更强的红色结节。这从牙髓干细胞的功能角度说明DPSCs存在于全部牙髓中，而且主要位于根髓之中。

4结论

体外培养的牙髓细胞中矿化小结的形成代表了DPSCs的存在，根部牙髓比冠部牙髓细胞更易于诱导矿化，提示DPSCs存在于根髓和冠髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度。

【参考文献】

1刘少华，魏奉才，孙善珍,等.牙髓细胞的原代培养方法探讨：冠部和根部牙髓的比较.上海口腔医学，2004，13:103-105.

2TsukamotoY,FukutaniS,Shin-IkeT,etal.Mineralizednoduleformationbyculturesofhumandentalpulp-derivedfibroblasts.ArchOralBiol,1992,37(12):1045-1055.

3AboutI,BotteroMJ,deDenatoP,etal.HumandentinproductioninCellRes,2000,258(1):33-41.

4SudoH,KodamaHA,AmagaiY,etal.Invitrodifferentiationandcalcificationinanewclonalosteogeniccelllinederivedfromnewbornmousecalvaria.JCellBiol,1983,96(1):191-198.

5HaradaH,KettunenP,JungHS,etal.LocalizationofputativestemcellsindentalepitheliumandtheirassociationwithNotchandFGFCellBiol,1999,147(1):105-120.

6MitsiadisTA,HirsingerE,LendahlU,etal.Delta-notchsignalinginodontogenesis:correlationwithcytodifferentiationandevidenceforfeedbackregulation.DevBiol,1998,204(2):420-431.

7MurrayPE,StanleyHR,MatthewsJB,etal.